[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)錄組測序文庫快速構建方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911384231.6
• 申請日: 2019-12-28
• 公開（公告）號: CN110951827B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 楊學敏;陳永順;張燕菲;高豐鑫
• 申請（專利權）人: 廣州表觀生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 廣州獨角熊知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 44580
• 代理人: 張小黎

1.一種轉(zhuǎn)錄組測序文庫快速構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）獲取樣品中的mRNA；

2）將1）所得產(chǎn)物加入含Mg²⁺的第一緩沖體系中，在90-105℃條件下反應，獲得片段化處理后的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物長度為100-300bp；

3）將2）所得產(chǎn)物加入cDNA第一鏈合成體系中得混合物，反應獲得含有cDNA第一鏈的產(chǎn)物，所述混合物中包括逆轉(zhuǎn)錄引物、TSO引物；其中：

所述逆轉(zhuǎn)錄引物可形成莖環(huán)結構，所述逆轉(zhuǎn)錄引物的序列包括：

莖區(qū)-環(huán)區(qū)-莖區(qū)-poly(N)區(qū)，N選自ATCG中的任一種，具體如下：GGAGATCGTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCNNNNNNN；

所述TSO引物的序列包括：

第一接頭序列-第二接頭序列-poly(G)區(qū)，具體如下：TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTrGrG+G；

所得cDNA第一鏈的5'末端連接有所述TSO引物，3'末端連接有所述逆轉(zhuǎn)錄引物；

4）將3）所得產(chǎn)物加入第一輪PCR體系中，擴增獲得第一輪PCR擴增產(chǎn)物，其中，所述第一輪PCR體系中，采用的擴增引物包括如下引物組：

引物組一：FR引物、P7 RF引物，

其中，F(xiàn)R引物的序列包括：TSO引物的第一接頭序列；P7 RF的序列包括：逆轉(zhuǎn)錄引物的環(huán)區(qū)-莖區(qū)序列；

5）將4）所得第一輪PCR擴增產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增，獲得mRNA文庫；其中，所述第二輪PCR擴增中，采用的擴增引物包括如下引物組：

引物組二：P5 FR引物、P7 RF引物，

其中，P5 FR的序列包括：TSO引物的第一接頭序列以及第二接頭序列。

2.如權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄組測序文庫快速構建方法，其特征在于，所述步驟2）中，所述第一緩沖體系為：

3.如權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄組測序文庫快速構建方法，其特征在于，所述步驟2）中，在94℃條件下片段化處理8-12分鐘獲得片段化處理后的mRNA。

4.如權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄組測序文庫快速構建方法，其特征在于，所述步驟3）中，所述第一鏈合成體系為：

5.如權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄組測序文庫快速構建方法，其特征在于，所述步驟3）中，所述第一鏈合成體系反應條件為：

6.一種轉(zhuǎn)錄組測序文庫快速構建試劑盒，其特征在于，包括如權利要求2所述的第一緩沖體系、如權利要求4所述的第一鏈合成體系。

7.一種如權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄組測序文庫快速構建方法或如權利要求6所述的轉(zhuǎn)錄組測序文庫快速構建試劑盒在構建轉(zhuǎn)錄組測序文庫中的應用。