[發(fā)明專利]一種轉錄組測序文庫快速構建方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911384231.6
• 申請日: 2019-12-28
• 公開（公告）號: CN110951827B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 楊學敏;陳永順;張燕菲;高豐鑫
• 申請（專利權）人: 廣州表觀生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 廣州獨角熊知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 44580
• 代理人: 張小黎

本發(fā)明提供了一種轉錄組測序文庫快速構建方法及其應用。相比于現(xiàn)有報道，本發(fā)明是專門針對100～300bp中小長度的RNA的高效文庫構建方法，合成cDNA前無需任何酶反應和化學反應處理，不會導致處理過程中RNA的降解和損耗；實驗過程快速、簡單，整個過程沒有對RNA和中間產物的復雜處理，特別適用于起始樣本量少的情況，實現(xiàn)高效的連接，最終得到濃度足夠高的轉錄組文庫，完成上機測序和后續(xù)的轉錄組測序相關的應用，有效實現(xiàn)單細胞、外泌體或珍貴臨床樣本的轉錄組測序在基礎研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等鄰域的廣泛應用。

本申請要求了2018年12月28日提交中國專利局的，申請?zhí)枮?01811620280.0，發(fā)明名稱為“一種轉錄組測序文庫快速構建方法及其應用”的中國專利申請的優(yōu)先權，其全部內容通過引用結合在本申請中。

技術領域

本發(fā)明涉及高通量測序及文庫構建領域，更具體地，涉及一種轉錄組測序文庫快速構建方法及其應用。

背景技術

cDNA文庫的構建是研究生物體功能基因組的主要技術手段。不同的RNA-seq高通量測序建庫方法，在覆蓋度、靈敏度和多路復用能力、所建文庫的全長率等方面表現(xiàn)各異。

轉錄組建庫時通常先去除總RNA中的rRNA，然后利用現(xiàn)有技術中的RNA文庫構建試劑盒進行轉錄組文庫的構建。真核細胞的mRNA 3’端都帶有Poly A。現(xiàn)有的轉錄組測序技術，一般利用逆轉錄酶對Poly A尾進行反轉錄，制備cDNA文庫。常見的做法是在合成cDNA的雙鏈后再兩端連上接頭，利用已知的接頭序列再進行擴增，或者是利用末端轉移酶在雙鏈cDNA的3’末端加上一連串的G或者C(或者A/T)，再通過補齊末端，利用已知的兩頭序列進行擴增。

轉錄組建庫常用試劑為NEB Ultra系列、Illumina Truseq系列及Kapa Hyper系列等，而建庫試劑中的接頭主要有三種經典結構，包括平端雙鏈接頭(以Thermo公司的建庫試劑為代表)、Y型結構雙鏈接頭(以Illumina公司的建庫試劑為代表)和U型結構單鏈接頭(以NEB公司的建庫試劑為代表)。以Illumina Truseq法為例，具體的常規(guī)流程如下：

1)總RNA的分離和純化：利用帶有oligo(dT)的磁珠將mRNA特異性吸附并分離出來，從而實現(xiàn)mRNA的純化；或除核糖體RNA(rRNA)；

2)將RNA打斷成200-600bp長度的片段；

3)合成反轉錄cDNA第一鏈：以片段化的RNA為模板，反轉錄成cDNA第一鏈，利用核酸純化磁珠分離此雜交鏈；

4)合成cDNA第二鏈：RNase降解雜交鏈中的RNA鏈，DNA聚合酶合成第二鏈，磁珠純化；

5)末端修復：用酶和dNTP將雙鏈cDNA末端補平；

6)加腺苷酸A；

7)加接頭：利用T4 DNA ligase將通用adapter加到DNA片段兩端，磁珠純化；

8)PCR擴增：利用高保真DNA聚合酶富集已加接頭的DNA雙鏈，磁珠純化。

但是，加接頭或末端修復再進行擴增，這些建庫方法都存在著一些不同程度的問題，比如，接頭的連接效率非常有限，會導致部分信息的丟失：平末端的雙鏈接頭效率中等，易形成接頭自連；Y型結構雙鏈接頭連接效率偏低，制作工藝需要額外添加退火步驟，而且退火前兩條單鏈的濃度及比例常因為定量問題而存在批次間產生比例失衡而不穩(wěn)定；U型結構單鏈接頭由于為單鏈結構，天然形成部分雙鏈的莖環(huán)結構，無需額外退火，連接效率高，不易產生接頭自連，但是需要在文庫PCR擴增之前使用酶把U型結構打開，增加實驗的步驟及試劑成本。