[發明專利]一種多片段DNA組裝試劑盒、多片段DNA組裝方法及其應用

在審

• 申請號: 201911382965.0
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN110964738A
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 朱佑民;楊平;孫健;柳偉強;劉敏祥;嚴成麗;邢妍婧;趙一凡
• 申請（專利權）人: 蘇州泓迅生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66;C12R1/865
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種多片段DNA組裝試劑盒、多片段DNA組裝方法及其應用，所述試劑盒包括待組裝的DNA片段F_n和載體；所述載體包括中間連接載體和/或組裝載體；所述試劑盒還包括釀酒酵母菌。本發明采用體外組裝和體內組裝相結合的方式，首先通過PCR合成初始片段并加入中間連接載體中，隨后采用重組酶體系將大片段DNA與組裝載體在體外進行組裝，再將體外組裝產物轉化入釀酒酵母菌進行體內組裝，結合了體外組裝和體內組裝的優點，顯著提高了超大質粒的合成成功率。

技術領域

本發明屬于合成生物學技術領域，涉及一種多片段DNA組裝試劑盒、多片段DNA組裝方法及其應用，尤其涉及一種多片段DNA組裝試劑盒、多片段DNA組裝方法及其在構建大片段重組質粒中的應用。

背景技術

近年來合成生物學迅速發展，在生物醫藥、能源和新材料等領域得到廣泛的應用。超大質?？梢苑沼诖笮痛x通路研究、染色體研究和基因組研究等，有助于進行基因功能、代謝通路功能研究和認識生命。但是，超大質粒的合成存在諸多困難，科學家們雖然提出了多種方法用于超大質粒的合成，但是普遍存在效率低下的問題。這就需要在超大質粒的合成和拼裝技術上進行改進和突破。

現階段，體外大片段組裝方法包括Gateway、In-fusion、Cold-fusion、T4 DNApolymerase-based Ligase Independent Cloning(LIC)、Golden Gate和Gibson Assembly等。其中，Gateway技術需要構建入門載體，耗時較長，成本較高；Golden Gate技術依賴于II型限制性內切酶和連接酶，不適用于存在上述酶的序列的合成，需要提前分析片段序列再進行組裝；而傳統的Gibson組裝技術在進行多片段組裝時效率較低，尤其是對于片段較大的片段，組裝成功率很低。

因此，需要提出新的高效的超大質粒組裝方法。

發明內容

針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供了一種多片段DNA組裝試劑盒、多片段DNA組裝方法及其應用，所述試劑盒將體外組裝和體內組裝相結合，顯著提高了多片段DNA組裝效率，提高了超大質粒的合成成功率。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種多片段DNA組裝試劑盒，所述試劑盒包括待組裝的DNA片段F_n和載體；

所述載體包括中間連接載體和/或組裝載體；

所述DNA片段F₁的上游和DNA片段F_n的下游包含中間連接載體的同源臂，即與中間連接載體的兩端具有相同的重疊序列；

所述DNA片段F_i的上游與DNA片段F_i-1的下游具有一段重疊的反向互補序列，所述DNA片段F_i的下游與DNA片段F_i+1的上游具有一段重疊的反向互補序列；

其中，n≥2且為偶數，1≤i≤n；

當i為奇數時，所述片段F_i為正向序列，當i為偶數時，所述片段F_i為反向互補序列；

所述試劑盒還包括釀酒酵母菌。

本發明中，所述試劑盒采用體外組裝和體內組裝相結合的方式，首先采用重組酶體系將大片段DNA與組裝載體在體外進行組裝，再將體外組裝產物轉化入釀酒酵母菌進行體內組裝，所述試劑盒結合了體外組裝和體內組裝的優點，解決了單純采用體外組裝或體內組裝構建超大質粒成功率低的問題。