[發(fā)明專利]一種多片段DNA組裝試劑盒、多片段DNA組裝方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911382965.0
• 申請(qǐng)日: 2019-12-27
• 公開（公告）號(hào): CN110964738A
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱佑民;楊平;孫健;柳偉強(qiáng);劉敏祥;嚴(yán)成麗;邢妍婧;趙一凡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州泓迅生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N15/66;C12R1/865
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種多片段DNA組裝試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括待組裝的DNA片段F_n和載體；

所述載體包括中間連接載體和/或組裝載體；

所述DNA片段F₁的上游和DNA片段F_n的下游包含中間連接載體的同源臂，所述DNA片段F_i的上游與DNA片段F_i-1的下游具有一段重疊的反向互補(bǔ)序列，所述DNA片段F_i的下游與DNA片段F_i+1的上游具有一段重疊的反向互補(bǔ)序列；

其中，n≥2且為偶數(shù)，1≤i≤n；

當(dāng)i為奇數(shù)時(shí)，所述片段F_i為正向序列，當(dāng)i為偶數(shù)時(shí)，所述片段F_i為反向互補(bǔ)序列；

所述試劑盒還包括釀酒酵母菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA片段F_n的長(zhǎng)度為50～75bp，優(yōu)選為60～65bp；

優(yōu)選地，所述重疊的反向互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度為18～30bp，優(yōu)選為20～25bp；

優(yōu)選地，所述中間連接載體包括PUC57-Amp。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括限制性內(nèi)切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶或重組酶中的任意一種或至少兩種的組合；

優(yōu)選地，所述限制性內(nèi)切酶包括EcoRV；

優(yōu)選地，所述DNA外切酶包括T5 DNA外切酶；

優(yōu)選地，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶；

優(yōu)選地，所述DNA連接酶包括T4 DNA連接酶；

優(yōu)選地，所述重組酶包括T5核酸外切酶和高保真Taq酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR緩沖液、dNTPs、重組緩沖液、酶切緩沖液或連接緩沖液中的任意一種或至少兩種的組合。

5.一種多片段DNA組裝方法，其特征在于，所述方法采用如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行多片段DNA組裝。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)利用PCR將待組裝的DNA片段F_n進(jìn)行拼接，得到拼接產(chǎn)物；

(2)將步驟(1)獲得的拼接產(chǎn)物與線性化的中間連接載體進(jìn)行重組反應(yīng)，或?qū)⒉襟E(1)獲得的平末端拼接產(chǎn)物平連入EcoRV酶切后的線性化的平末端中間連接載體中；

(3)將步驟(2)獲得的連接產(chǎn)物采用DNA片段F₁和DNA片段F_n作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到用于構(gòu)建大片段DNA的初始片段；

(4)將步驟(3)獲得的初始片段與線性化的組裝載體進(jìn)行體外組裝；

(5)將步驟(4)獲得的體外組裝產(chǎn)物導(dǎo)入釀酒酵母菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行體內(nèi)組裝。