[發(fā)明專利]一種高效體外培養(yǎng)臍血CIK細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

有效

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• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN110938595B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 譚嘯;譚新民
• 申請（專利權(quán)）人: 譚嘯
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

本發(fā)明公開了一種高效體外培養(yǎng)臍血CIK細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述培養(yǎng)基組分包括AlyS505N?0無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞因子組合物A和天然的中藥提取物。培養(yǎng)方法為：采集分離臍帶血單個核細(xì)胞，重懸細(xì)胞，加入IFN?γ活化，置于37℃、6%CO₂培養(yǎng)箱中孵育，第二天加入細(xì)胞因子組合物A刺激，3?5天后補充含中藥提取物B的培養(yǎng)基，培養(yǎng)期間每隔2?3天補充含中藥提取物組合B的培養(yǎng)基，共培養(yǎng)15?17天的到大量的CIK細(xì)胞。本培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法能使CIK細(xì)胞大量增殖，其中細(xì)胞中CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞能達70%以上。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

CIK又稱多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，是將人外周血或者臍帶血的單個核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。由于該種細(xì)胞同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故又稱為NK樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強大的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點。

CIK細(xì)胞在正常的人外周血中極其罕見，僅1%-5%，通過我們體外培養(yǎng)15天左右細(xì)胞迅速增殖，較培養(yǎng)前可擴增1000倍以上，其中效應(yīng)細(xì)胞即同時表達CD3+CD56+的細(xì)胞不僅絕對數(shù)量增加1000倍以上，且所占比例也大幅提升。

而傳統(tǒng)的培養(yǎng)基組合，培養(yǎng)時間需要25-28天細(xì)胞數(shù)量才達到平臺期，細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞毒活性才能達到峰值。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供一種高效體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。該方法能使CIK細(xì)胞15-17天快速擴增1000倍以上，獲得高濃度的CIK細(xì)胞。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種高效體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞的培養(yǎng)基，其組分包含：在AlyS505N-0無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子組合物A和中藥提取物B；其中細(xì)胞因子組合物A包含濃度為20-200IU/ml的IL-1α、濃度為500-2000IU/ml的IL-2、濃度為20-100μg/ml的Lymactin-T；中藥提取物B包含濃度1-5μg/ml的蟲草素、濃度1-5μg/ml的人參皂苷、濃度3-8μg/ml的紫杉醇、濃度5-10μg/ml的茯苓多糖、濃度2-6μg/ml的黃芪甲苷和濃度3-5μg/ml的姜醇。

優(yōu)選的，上述培養(yǎng)基中所述中藥提取物B包含濃度2μg/ml的蟲草素、濃度4μg/ml的人參皂苷、濃度4.5μg/ml的紫杉醇、濃度4μg/ml的茯苓多糖、濃度2.5μg/ml的黃芪甲苷和濃度4μg/ml的姜醇。

一種利用上述培養(yǎng)基高效體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）采集健康臍帶血并分離臍帶血單個核細(xì)胞，向核細(xì)胞中加入AlyS505N-0基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕吹打，重懸混勻，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞接種濃度為1.5×10⁶個/ml，加入800IU/ml的IFN-γ，置入37℃，6%CO₂飽和濕度下培養(yǎng)；

（2）培養(yǎng)至24小時，按培養(yǎng)基組分添加細(xì)胞因子組合A；繼續(xù)置于37℃，6%CO₂飽和濕度下培養(yǎng)；

（3）培養(yǎng)至72小時，按培養(yǎng)基組分添加含中藥提取物B和300-800IU/ml IL-2的AlyS505N-0基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并繼續(xù)置于37℃，6%CO₂飽和濕度下培養(yǎng)；

（4）之后每隔2-3天，添加含300-800IU/ml IL-2的AlyS505N-0基礎(chǔ)培養(yǎng)基，共培養(yǎng)15-17天的到大量的CIK細(xì)胞。

通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明的培養(yǎng)體系具有如下有益效果：