[發明專利]一種大規模制備高純度不飽和透明質酸二糖的方法

有效

• 申請號: 201911377680.8
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN110982862B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 喬莉蘋;石艷麗;陳玉娟;李強;馮寧;周寧;劉福全;郭學平;劉愛華
• 申請（專利權）人: 華熙生物科技股份有限公司;山東華熙海御生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12P19/14;C07H3/04;C07H1/06
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 賈波

本發明公開了一種大規模制備高純度不飽和透明質酸二糖的方法，該方法采用兩步酶解和兩步純化，先利用透明質酸酶酶解高分子透明質酸或其鹽，所得產物用低有機溶劑倍數進行純化，得到純度較高的低分子量透明質酸或其鹽，進而對低分子量透明質酸或其鹽進行徹底酶解，所得產物用高有機溶劑倍數進行純化，得到高純度不飽和透明質酸二糖。該方法工藝流程操作簡單，條件溫和，生產效率高，能耗相對較低，適合大規模工業化生產。所得產品純度高、細胞毒性低、具有促進人臍靜脈內皮細胞及人角膜上皮細胞增殖的特點，可以作為標準品用作透明質酸及其相關產品的含量及純度檢測，在醫藥領域也具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種不飽和透明質酸二糖的制備方法，特別涉及一種純度高、產量大、適合大規模生產的不飽和透明質酸二糖的制備方法，屬于寡聚透明質酸制備技術領域。

背景技術

透明質酸(hyaluronic acid，HA)是一種廣泛存在于人及哺乳動物體內的酸性黏多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重復單位通過β-(1→4)糖苷鍵和β-(1→3)糖苷鍵構成、無分支的單鏈高分子糖胺聚糖。由于透明質酸獨特的物理學特性、高保濕性、粘彈性、潤滑性，廣泛用于醫藥、化妝品、食品等領域，分子量一般為10⁵~10⁷Da（道爾頓）。

寡聚透明質酸是指分子量小于10 kDa的透明質酸。有研究認為，不同的分子量的透明質酸有著不同的甚至完全相反的生物活性，高分子量透明質酸由于其保濕性、粘彈性及潤滑性常被應用在滴眼液、美容填充及骨科填充等領域，但當透明質酸的分子量降低至寡糖的水平時（10 kDa以下），透明質酸寡糖表現出與高分子量透明質酸完全不同的性能，具有抗氧化性、透皮吸收、創傷修復的活性。不飽和透明質酸二糖分子量為383Da，是透明質酸經過細菌產透明質酸酶酶解制備的透明質酸二糖，與透明質酸二糖結構相區別的是，不飽和透明質酸二糖在葡萄糖醛酸的4,5糖苷鍵處形成不飽和鍵。經前期研究發現，不飽和透明質酸二糖（ΔDiHA）具有較強的抗氧化性，并能夠明顯促進人臍靜脈內皮細胞及人角膜上皮細胞增殖，在醫藥領域具有廣闊的應用前景。另外，高純度不飽和透明質酸二糖（ΔDiHA）也可以作為標準品，用作透明質酸及其相關產品的含量及純度檢測。

李強在其畢業論文中公開了一種不飽和透明質酸二糖的制備方法（李強. 不飽和透明質酸二糖的制備和活性研究[D]. 山東大學, 2013），該方法以高分子透明質酸為原料，通過一次酶解、酶滅活、冷凍干燥的步驟制備不飽和透明質酸二糖。該工藝采用凍干工藝得到不飽和透明質酸二糖，批次產量過低，高耗能，效率低下，無法應用于透明質酸不飽和二糖的大規模制備。有機溶劑沉淀提取產物的方式是工業上常用的透明質酸提取方式，但由于不飽和透明質酸二糖自身的吸水性高，分子量低(383 Da)，且采用高分子透明質酸為原料，溶液中底物濃度低，因此很難通過有機溶劑沉淀的方式得到不飽和透明質酸二糖。

CN107460184A 公開了一種鏈霉菌屬來源的透明質酸裂解酶HyaL16-3及其編碼基因與應用，其將透明質酸裂解酶HyaL16-3的編碼基因插入到表達載體中，使其在宿主細胞大腸桿菌BL21(DE3）中表達，所得透明質酸裂解酶用于降解透明質酸，從而制備不飽和透明質酸二糖。該專利所得的透明質酸裂解酶酶活很低，其對透明質酸的比活僅為10306 U/mg，容易引入更多雜質，降解后需要經過分子凝膠色譜柱分離純化，并需經過反復冷凍干燥脫鹽才能得到純度較高的不飽和透明質酸二糖。該方法工藝復雜、產品純化難度大、能耗高、成本高，無法實現大規模生產，且重組菌株的安全性也有待考量。

CN201210499375.8公開了一種低分子透明質酸鹽的酶解制備方法，采用0.1%~2%的透明質酸鹽溶液進行酶解，然后加入無機鹽以便增強溶液的離子強度進而進行有機溶劑沉淀獲得低分子透明質酸及其鹽，隨著低分子透明質酸及其鹽分子量的降低，需要不斷的提高有機溶劑的添加濃度以使透明質酸沉淀析出，但無機鹽在高濃度的有機溶劑中也會沉淀析出，因此在沉淀的過程中勢必會造成無機鹽殘留。