[發明專利]一種大規模制備高純度不飽和透明質酸二糖的方法

有效

• 申請號: 201911377680.8
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN110982862B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 喬莉蘋;石艷麗;陳玉娟;李強;馮寧;周寧;劉福全;郭學平;劉愛華
• 申請（專利權）人: 華熙生物科技股份有限公司;山東華熙海御生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12P19/14;C07H3/04;C07H1/06
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 賈波

1.一種大規模制備高純度不飽和透明質酸二糖的方法，其特征是包括以下步驟：

（1）將透明質酸酶加入pH4~9的水中，配成酶解緩沖液；

（2）在攪拌下向酶解緩沖液中加入高分子透明質酸或其鹽，高分子透明質酸或其鹽與酶解緩沖液的質量體積比為1~2 g:10 ml，酶解至透明質酸或其鹽的分子量為50 kDa~100kDa時升溫進行滅活；

（3）向步驟（2）滅活后的反應液中加入有機溶劑進行沉淀，過濾，所得沉淀洗滌、干燥，得低分子量透明質酸或其鹽；

（4）按照步驟（1）的方法配制酶解緩沖液，在攪拌下向該酶解緩沖液中加入步驟（3）的低分子量透明質酸或其鹽，低分子量透明質酸或其鹽與酶解緩沖液的質量體積比為3~9 g：10 ml，酶解直至終點；

（5）將酶解液用活性炭進行吸附，吸附后過濾，所得濾液用有機溶劑沉淀，所得沉淀干燥，得不飽和透明質酸二糖；

步驟（1）中，所述透明質酸酶為芽孢桿菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744發酵生產的透明質酸酶，其比活大于1.4×10⁷ IU/mg；

步驟（2）中，所述高分子透明質酸或其鹽以連續的方式加入或以間歇的方式加入；

步驟（3）和（5）中，所述有機溶劑均為乙醇、丙醇、異丙醇或乙二醇。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是：步驟（2）中，酶解緩沖液中透明質酸酶的用量與加入的高分子透明質酸或其鹽總質量的比值為：1×10⁵~1×10⁶ IU：1 kg；步驟（4）中，酶解緩沖液中透明質酸酶的用量與加入的低分子量透明質酸或其鹽總質量的比值為：1×10⁷~1×10⁹ IU：1 kg。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是：步驟（4）中，低分子量透明質酸或其鹽與酶解緩沖液的質量體積比為4.5~7.5 g：10 ml。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是：步驟（3）和（5）中，所述有機溶劑均為乙醇。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是：步驟（3）中，加入有機溶劑至酶解液中有機溶劑的體積濃度為70%~85%。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是：步驟（5）中，加入有機溶劑至酶解液中有機溶劑的體積濃度為88~99%。

7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是：步驟（5）中，加入有機溶劑至酶解液中有機溶劑的體積濃度為90~92%。

8.根據權利要求1-7中任一項所述的制備方法，其特征是：步驟（4）中，所述低分子量透明質酸或其鹽以連續的方式加入或以間歇的方式加入。

9.根據權利要求1-7中任一項所述的制備方法，其特征是：步驟（2）中，所述高分子透明質酸或其鹽的分子量大于等于1000 kDa。

10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征是：步驟（2）中，所述高分子透明質酸或其鹽的分子量為1000 kDa~2000 kDa。

11.根據權利要求1-7中任一項所述的制備方法，其特征是：步驟（2）中，所述高分子透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽。

12.根據權利要求1-7中任一項所述的制備方法，其特征是：步驟（2）中，攪拌速度為10~50 rpm；步驟（4）中，攪拌速度為10~50 rpm。

13.根據權利要求1-7中任一項所述的制備方法，其特征是：步驟（2）和（4）中，酶解溫度均為20~48℃；步驟（2）和（4）中，酶解pH均為5.5~7.5。