[發明專利]一種芋病毒的多重RT-PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201911377270.3
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN110923365A
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 蔣璐;殷劍美;張培通;韓曉勇;王立;郭文琦;李春宏
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/94
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 鄒仕娟

本發明屬于植物病毒檢測領域，尤其是一種芋病毒的多重RT?PCR檢測方法，針對現有用于檢測芋病毒病的方法主要有直接觀測法、血清法、電鏡法和RT?RCR技術等，其中直接觀測法主觀性強；電鏡檢測需要大型精密設備且操作繁瑣；血清法目前僅DsMV病毒有成品的檢測試劑盒，且成本高、靈敏度低的問題，現提出如下方案，其包括以下步驟：S1：采集疑似帶病毒的芋植株葉片，樣品經液氮快速冷凍后置于?80℃冰箱保存。該方法能穩定地同時擴增出DsMV、CMV及CBDV特異片段，其大小分別為942、202和437bp，經過克隆、測序和比對分析，明確了檢測出的病毒序列與已公布的病毒序列具有高度同源性。

技術領域

本發明涉及植物病毒檢測技術領域，尤其涉及一種芋病毒的多重RT-PCR檢測方法。

背景技術

芋是天南星科芋屬多年生草本濕生植物，原產于中國、印度、馬來半島等熱帶沼澤地區，在一些太平洋島嶼國家，芋是非常重要的糧食和營養來源，根據聯合國糧農組織(FAO)統計，中國芋的栽培面積連續多年穩居世界前四(FAOSTAT，2017)，主要分布于江蘇、山東、浙江、廣西、廣東和云南等省，我國芋資源非常豐富，栽培品種較多，僅江蘇省就有7個芋地方特色品種被認定為中國地理標志農產品，芋主要通過球莖繁殖，長期無性繁殖導致植株病毒積累，是造成芋種性退化的主要原因，迄今為止，在全世界已發現的侵染芋的病毒有10多種，其中芋花葉病毒是芋生產上最主要的病毒病害之一，黃瓜花葉病毒是我國分布較廣的主要病毒，還有芋瘦小病毒是侵染芋的一種新型彈狀病毒科病毒，由于病毒可經種苗、種子、機械和蚜蟲等媒介傳播，目前尚無有效的化學防治方法，因此帶病植株的早期發現拔除和利用莖尖脫毒提純種苗成為預防芋病毒的最為有效的方法，芋生產過程和脫毒組培苗制備過程中，病毒檢測是至關重要的環節，因此，建立快速、準確、高效和穩定的芋病毒檢測技術有利于芋病毒病害的早期防控以及脫毒技術的發展，對保障芋質量、脫毒苗的檢測具有重要意義。

用于檢測芋病毒病的方法主要有直接觀測法、血清法、電鏡法和RT-RCR技術等，其中直接觀測法主觀性強；電鏡檢測需要大型精密設備且操作繁瑣；血清法目前僅DsMV病毒有成品的檢測試劑盒，且成本高、靈敏度低。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中存在用于檢測芋病毒病的方法主要有直接觀測法、血清法、電鏡法和RT-RCR技術等，其中直接觀測法主觀性強；電鏡檢測需要大型精密設備且操作繁瑣；血清法目前僅DsMV病毒有成品的檢測試劑盒，且有成本高、靈敏度低的缺點，而提出的一種芋病毒的多重RT-PCR檢測方法。

為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：

一種芋病毒的多重RT-PCR檢測方法，包括以下步驟：

S1：采集疑似帶病毒的芋植株葉片，樣品經液氮快速冷凍后置于-80℃冰箱保存；

S2：采用植物total RNA提取試劑盒進行葉片總RNA提取，反轉錄參照Takara試劑盒操作方法進行，1.0μL Primer Oligo(dT)、11μL總RNA樣品和DEPC處理水至反應管中，輕輕混勻并離心；

S3：將反應管置于ABI 7500PCR儀中65℃反應5min后，立即轉移至冰上靜置5min，之后于上述反應液體中加入4.0μL 5×反轉錄酶緩沖液、1.0μL RNase抑制劑、1.0μL反轉錄酶及2.0μL dNTP，總體積調整至20μL，輕輕混勻并離心，將反應管置于PCR儀中42℃反應90min，70℃反應5min，反應結束后迅速放在冰上冷卻備用；

S4：根據GenBank公布的芋花葉病毒(DsMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)及芋瘦小病毒(CBDV)3種病毒外殼蛋白(CP)和GAPDH基因序列，應用Primer Premier 5.0軟件分別設計3種病毒和芋內參的特異性引物；