[發明專利]一種芋病毒的多重RT-PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201911377270.3
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN110923365A
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 蔣璐;殷劍美;張培通;韓曉勇;王立;郭文琦;李春宏
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/94
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 鄒仕娟

1.一種芋病毒的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：采集疑似帶病毒的芋植株葉片，樣品經液氮快速冷凍后置于-80℃冰箱保存；

S2：采用植物total RNA提取試劑盒進行葉片總RNA提取，反轉錄參照Takara試劑盒操作方法進行，1.0μL Primer Oligo(dT)、11μL總RNA樣品和DEPC處理水至反應管中，輕輕混勻并離心；

S3：將反應管置于ABI 7500PCR儀中65℃反應5min后，立即轉移至冰上靜置5min，之后于上述反應液體中加入4.0μL 5×反轉錄酶緩沖液、1.0μL RNase抑制劑、1.0μL反轉錄酶及2.0μL dNTP，總體積調整至20μL，輕輕混勻并離心，將反應管置于PCR儀中42℃反應90min，70℃反應5min，反應結束后迅速放在冰上冷卻備用；

S4：根據GenBank公布的芋花葉病毒(DsMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)及芋瘦小病毒(CBDV)3種病毒外殼蛋白(CP)和GAPDH基因序列，應用Primer Premier 5.0軟件分別設計3種病毒和芋內參的特異性引物；

S5：以反轉錄cDNA為模板，分別使用DsMV、CBDV和CMV病毒的特異性引物對樣品進行PCR擴增，RT-PCR體系為20μL：2.0μL cDNA，3種病毒的上游引物和下游引物(10μmol·L-1)各1.0μL，2×Tag Mix 10.0μL，ddH2O補足至20μL，反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循環35次；最后72℃延伸10min，4℃保存；

S6：在單引物RT-PCR基礎上，篩選擴增條帶單一、穩定的引物并進行多重引物的組合，通過對RT-PCR條件：退火溫度以及循環次數的調節，優化芋3種病毒的多重RT-PCR體系；

S7：RT-PCR反應結束后，用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，上樣量為8μL，100V穩壓電泳30分鐘，凝膠紫外成像觀察并拍照；

S8：芋3種病毒擴增出的單一產物，經過電泳分離割膠回收，并采用Takara公司DNA純化試劑盒純化，純化后產物與pMD18-T vector連接，經熱激轉化DH5α后，通過PCR篩選獲得陽性克隆，送至擎科生物技術有限公司進行測序。在NCBI上通過BLAST對克隆獲得的序列進行比對分析；

S9：根據芋3種病毒各自的外殼(CP)蛋白保守序列分別設計引物10對(DsMV)、8對(CMV)和5對(CBDV)，同時通過軟件DNAMAN分析引物間的互補性及引物的退火溫度，結果發現當退火溫度為56-58℃時，其擴增片段大小差異明顯，獲得3種病毒特異性引物(編號分別是DsMV、CMV-1和CBDV-1)，單一RT-PCR擴增產物分別為942、202和437bp特異性條帶，同時利用篩選到的3種病毒的特異性引物，檢測當年收集的疑似病毒植株，篩選出帶有單個病毒的植株，作為該病毒的陽性對照；

S10：將帶有DsMV、CMV和CBDV單個病毒的cDNA混合作為3種病毒的陽性混合對照，以GAPDH基因為內參，將病毒特異性引物DsMV，CMV-1，CBDV-1兩兩組合或三組混合，進行多重RT-PCR，發現可以獲得引物組合目標的設計片段；

S11：多重RT-PCR體系的優化篩選中，退火溫度設置在52℃，引物二聚體增多，擴增產物模糊，54-58℃產物比較穩定，在退火溫度56℃，在相同條件下長片段引物的擴增產物較弱，這是由于在同一個RT-PCR體系中，引物存在競爭性，片段較短，易于擴增反應，因此，延伸時間控制在1min，適當增加擴增片段較長的DsMV引物的濃度，增加循環次數到40次可以提高3種病毒的擴增效果；

S12：經過多重RT-PCR的調整，得到的優化反應體系為：cDNA 2μL，DsMV引物(10μmol·L-1)2.0μL，CMV-1和CBDV-1引物(10μmol·L-1)各1.0μL，2×Tag Mix 10.0μL，ddH2O補足至20μL，擴增反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，增加循環數至40次；最后72℃延伸10min。

2.根據權利要求1所述的一種芋病毒的多重RT-PCR檢測方法可以應用于對本年度中芋不同生產區收集的疑似樣品進行檢測，結果發現DsMV的檢出率是最高的，且在自然條件下檢測到了同時感染DsMV和CMV的樣本，但沒有檢測到同時感染DsMV、CMV和CBDV的植株，芋脫毒組培苗的檢測中，沒有發現帶CMV和CBDV的感毒株。