[發(fā)明專利]一種抗sST2單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911376360.0
• 申請(qǐng)日: 2019-12-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110964106A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王勇;邱河
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州博方生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/68
• 代理公司: 廣州哲力智享知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44494
• 代理人: 余全平

本發(fā)明公開(kāi)了一種抗sST2單克隆抗體的制備方法，包括sST2重組蛋白的制備、動(dòng)物免疫、雜交瘤細(xì)胞的制備和單克隆抗體的制備，選擇特定的sST2基因片段，優(yōu)化了原核表達(dá)系統(tǒng)的條件，提高了蛋白的表達(dá)量和重組蛋白的純度，免疫小鼠可以產(chǎn)生更高效價(jià)的抗體，制備的雜交瘤細(xì)胞株可持久、高效分泌高性能的抗sST2單克隆抗體。本發(fā)明還公開(kāi)了一種抗sST2單克隆抗體，均為IgG1亞型，抗體的一致性好，效價(jià)高，免疫活性高、親和力強(qiáng)，檢測(cè)sST2的穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性和靈敏度高。本發(fā)明還公開(kāi)了一種sST2單克隆抗體在免疫檢測(cè)sST2產(chǎn)品中的應(yīng)用，檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗sST2單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

心力衰竭是眾多心血管疾病的共同轉(zhuǎn)歸，其患病率在全球日益升高其病理生理機(jī)制，至今未能完全闡明。目前，對(duì)心力衰竭管理有明確診斷和評(píng)估價(jià)值的生物標(biāo)志物僅有利鈉肽，包括B型利鈉肽(BNP)和氨基末端B型利鈉肽(NT-proBNP)。但BNP為單一生物標(biāo)志物，僅能反映心力衰竭病理生理機(jī)制的一個(gè)方面，且受腎臟功能、年齡、BMI以及不同原因所致肺動(dòng)脈高壓等的影響，臨床亟需更多生物標(biāo)志物以反映不同病理生理機(jī)制，對(duì)心力衰竭患者做出更準(zhǔn)確和完整的評(píng)估。

在各種新興生物標(biāo)志物中，sST2反映心肌細(xì)胞受到生物機(jī)械刺激后的應(yīng)變，是心肌細(xì)胞肥厚和纖維化的標(biāo)志，且不受年齡、腎功能損害和體重指數(shù)的影響被認(rèn)為在心力衰竭和其他心血管疾病中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。與傳統(tǒng)的心衰標(biāo)志物相比，sST2有著更強(qiáng)大的死亡預(yù)測(cè)能力，這對(duì)于心衰的預(yù)后有著極其重要的意義。目前，國(guó)外市場(chǎng)上已出現(xiàn)sST2檢測(cè)試劑盒，但價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)sST2檢測(cè)產(chǎn)品尚比較少，并且多為科研試劑，臨床上的應(yīng)用報(bào)道較少。因此，制備性能優(yōu)異的抗sST2單克隆抗體，研發(fā)性能優(yōu)良的國(guó)產(chǎn)sST2定量檢測(cè)試劑盒，對(duì)于降低醫(yī)療費(fèi)用、提升患者滿意度具有極其重要的社會(huì)意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種抗sST2單克隆抗體的制備方法，選擇特定的sST2基因片段，優(yōu)化了原核表達(dá)系統(tǒng)的條件，提高了蛋白的表達(dá)量和重組蛋白的純度，免疫小鼠可以產(chǎn)生更高效價(jià)的抗體，制備的雜交瘤細(xì)胞株可持久、高效分泌高性能的抗sST2單克隆抗體。

本發(fā)明的目的之而在于提供一種抗sST2單克隆抗體，由上述方法制備，均為IgG1亞型，抗體的一致性好，效價(jià)高，免疫活性高、親和力強(qiáng)，檢測(cè)sST2的穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性和靈敏度高。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種上述sST2單克隆抗體在免疫檢測(cè)sST2產(chǎn)品中的應(yīng)用，抗體的穩(wěn)定性強(qiáng)，檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好。

本發(fā)明的目的之一采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種抗sST2單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

sST2重組蛋白的制備：將sST2基因片段插入pET-28A(+)質(zhì)粒中，獲得PET-28A-sST2表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，在含有IPTG的LB液體培養(yǎng)基中22-37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4-6h，提取、純化即得高純度的sST2重組蛋白；所述sST2基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示

動(dòng)物免疫：將45-55μg所述sST2重組蛋白與相同體積的福氏佐劑充分乳化后，于BALB/c小鼠背部皮下多點(diǎn)注射免疫4次，每次免疫時(shí)間間隔為14d，篩選體內(nèi)抗體效價(jià)為1：(150000-160000)的小鼠作為免疫小鼠；

雜交瘤細(xì)胞的制備：對(duì)所述免疫小鼠腹腔注射不加佐劑的sST2重組蛋白95-105μg，提取脾細(xì)胞懸浮液與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)選擇性培養(yǎng)后，再進(jìn)行3次亞克隆，即得能穩(wěn)定分泌特異性抗sST2抗體的雜交瘤細(xì)胞；