[發明專利]一種檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201911372115.2
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN110951866A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 吳鴻;韓勇軍;高水波;王振濤;雷震;王新洲;高海霞
• 申請（專利權）人: 河南中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠榆知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

本發明公開一種檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的引物及其檢測方法，包括重亞硫酸鹽轉化后GPVI基因啟動子區的擴增引物對和測序引物GPVI?S；上游引物GPVI?F的序列為5′?ATTAGGGAGTTTATGGGAGTACGG?3′，下游引物GPVI?R的序列為：5′?Biotin?ATTCCTCAACCCTATCCTAAACTCTAT?3′；測序引物GPVI?S的序列為：5′?AATATAGATTAGGTTTTAGTAGG?3′。本申請采用焦磷酸測序法進行測序，高效檢測目標區域CpG島甲基化和非甲基化比例，評估GPVI啟動子區甲基化水平，可作為發生心肌梗死的早期指標。

技術領域

本發明涉及生物基因檢測技術領域。具體地說是一種檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的引物及其檢測方法。

背景技術

血小板過度活化會引起不必要的血小板聚集，最終導致血栓形成，引發心血管疾病。近年來，很多研究顯示冠心病發生發展過程中與基因表觀遺傳學DNA甲基化模式絮亂有密切關系。因此，研究DNA甲基化在冠心病發病過程中的作用機制，可為冠心病的診斷和治療提供新思路。

在血小板參與冠心病發生發展過程中，血小板膜上的受體起著關鍵作用。糖蛋白VI(glycoprotein VI，GPVI)是血小板膜上眾多受體之一，也是目前研發新型抗血栓藥物的熱門靶點。人GPVI基因定位于染色體19q13.4-42，DNA片段長度約為23000bp，基因組結構由8個外顯子和7個內含子構成，為I型跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族的一員。GPVI只在血小板及血小板前體細胞--骨髓中的巨核細胞上表達，它是膠原的主要受體，介導血小板與膠原的黏附，并把這一黏附信號通過與其相連的FcRγ鏈“自外而內”傳遞到血小板內部，開始一系列介導血小板活化的活動，通過激活Syk激酶，發生信號級聯放大反應，SLP76、PI3K、Btk、PLCγ2與PKC的逐步激活，胞質中Ca²⁺濃度升高引起細胞骨架的變化、血小板形狀改變并分泌顆粒，這些血小板的反應通過血栓烷A2受體和腺苷二磷酸(adenosinediphosphate，ADP)受體P2Y1、P2Y12將信號進一步加強，最終使整合素αIIbβ3活化，血小板聚集，形成血栓。研究表明，缺乏GPVI可顯著抑制膠原誘導的血小板黏附、聚集和血栓形成。在一例ITP患者血漿中檢測到抗GPVI自身抗體，證實是其自身抗體特異性結合GPVI陽性血小板，清除血漿中可溶性GPVI，導致血小板不能結合膠原，也不能形成血栓。另外，敲除GPVI-Fc二聚體亦可有效阻止血小板聚集，但未延長出血時間，提示減少GPVI水平可阻止血栓形成，但又不引起病理性出血。另外，研究顯示在心血管疾病患者中，GPVI在血小板膜上的表達量增加，且高水平GPVI與不良臨床事件相關，是獨立的心肌梗死的危險因素，提示GPVI異常增高可作為發生心肌梗死的早期指標。

表觀遺傳學是調控基因組功能的重要方式，DNA甲基化是表觀遺傳修飾中最重要的形式之一。大多數哺乳動物基因組DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5′端的非編碼區，并成簇存在。DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶在DNA甲基轉移酶(DNMTs)的催化下，選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，這常見于基因的5′-CG-3′序列。一個CpG位點的DNA甲基化狀態由DNA甲基轉移酶和去甲基化酶共同調節，可通過細胞分裂遺傳下去。當CpG位點處于甲基化狀態時，會導致某些區域DNA構象變化，使其結構收縮，螺旋加深，從而影響轉錄因子或輔激活因子與DNA上相關調控區域的相互作用，而不利于轉錄的起始，導致靶基因表達降低，表現為沉默狀態。相反地，當CpG位點處于去甲基化修飾狀態時，染色體的緊縮結構將被打開，呈現出疏松的狀態，有利于轉錄因子或輔激活因子接近于DNA序列，因此該修飾狀態與基因的活化有關。通過基因序列分析發現在GPVI 5′調節區和啟動子區-1576到+75間有多個CpG島，我們前期研究發現，與健康組相比，冠心病組GPVI啟動子區甲基化水平明顯降低，而GPVI mRNA水平顯著升高，提示GPVI通過啟動子區甲基化調控自身基因表達。鑒于此，有必要建立了快速檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的方法。

發明內容