[發明專利]一種檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201911372115.2
• 申請日: 2019-12-27
• 公開（公告）號: CN110951866A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 吳鴻;韓勇軍;高水波;王振濤;雷震;王新洲;高海霞
• 申請（專利權）人: 河南中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠榆知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

1.一種檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的引物，其特征在于，包括重亞硫酸鹽轉化后GPVI基因啟動子區的擴增引物對和測序引物GPVI-S；

所述擴增引物對包括上游引物GPVI-F和下游引物GPVI-R，所述上游引物GPVI-F的序列為5′-ATTAGGGAGTTTATGGGAGTACGG-3′，所述下游引物GPVI-R的序列為：5′-Biotin-ATTCCTCAACCCTATCCTAAACTCTAT-3′；

所述測序引物GPVI-S的序列為：5′-AATATAGATTAGGTTTTAGTAGG-3′。

2.一種檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的檢測方法，其特征在于，使用權利要求1所述的擴增引物對，對重亞硫酸鹽轉化后人血液GPVI基因啟動子區進行擴增，并使用所述測序引物GPVI-S對所檢測的基因區域的5個CpG位點的甲基化比例進行檢測，通過檢測得到的甲基化率，測定GPVI基因在血液中的表達水平。

3.根據權利要求2所述的檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)血液樣本采集；

(2)白細胞分離；

(3)基因組DNA提取；

(4)重亞硫酸鹽轉化；

(5)GPVI基因啟動子區PCR擴增反應；

(6)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物；

(7)焦磷酸測序反應和結果分析。

4.根據權利要求3所述的檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的檢測方法，其特征在于，在步驟(1)中，使用EDTA抗凝管采集人靜脈血2ml。

5.根據權利要求3所述的檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的檢測方法，其特征在于，在步驟(2)中，使用Ficoll密度梯度法分離人靜脈血中的白細胞。

6.根據權利要求3所述的檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的檢測方法，其特征在于，在步驟(3)中，使用Biospin全血基因組DNA提取試劑盒提取白細胞基因組DNA。

7.根據權利要求3所述的檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的檢測方法，其特征在于，在步驟(4)中，使用EZ DNA甲基化全套試劑盒-gold中的重亞硫酸鹽處理步驟(3)中基因組DNA樣本。

8.根據權利要求3所述的檢測GPVI基因啟動子區甲基化水平的檢測方法，其特征在于，在步驟(5)中，重亞硫酸鹽轉化后GPVI基因啟動子區的擴增引物對，包括上游引物GPVI-F和下游引物GPVI-R，

上游引物GPVI-F的序列為5′-ATTAGGGAGTTTATGGGAGTACGG-3′，

下游引物GPVI-R的序列為5′-Biotin-ATTCCTCAACCCTATCCTAAACTCTAT-3′；所述擴增目標基因片段大小為166bp；

PCR擴增反應體系為：為30uL的混合體系，包括

0.3μL的TaKaRa Taq HS，TaKaRa Taq HS濃度為5U/μL；

3μL的10x PCR Buffer；

2.4μL的dNTP Mixture，濃度為2.5mM,

3μL的重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA，重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA的濃度為10～20ng·μL^-1；

1.0μL的上游引物GPVI-F，上游引物GPVI-F的濃度為10μM；

1.0μL的下游引物GPVI-R，下游引物GPVI-R的濃度為10μM；

19.3μL的無菌去離子水；

PCR反應程序為：

(P-1)95℃預變性2min，

(P-2)95℃變性10s，

(P-3)55℃的退火30s，

(P-4)72℃延伸30s，

(P-5)步驟(P-1)到步驟(P-4)循環30次，

(P-6)72℃終延伸5min。