[發明專利]一種用于蛋白展示和表達的細胞株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201911367664.0
• 申請日: 2019-12-26
• 公開（公告）號: CN110982790B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 趙云;范英俊;安莉莉;杭海英
• 申請（專利權）人: 海珂分子（北京）科技有限責任公司;中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

本發明提供了一種可用于蛋白展示和表達的CHO細胞，所述CHO細胞的基因組中整合有表達框，所述表達框整合于CHO細胞基因組的YWHAE基因的終止密碼子之后；所述表達框包括啟動子、第一重組酶識別序列、目的基因、第二重組酶識別序列、終止子。在該細胞中，熒光蛋白基因和抗體基因可以高轉錄并且在無抗生素維持的情況下持續穩定高表達，抗體轉錄水平相對于之前建立的CHO?puro細胞株有了顯著的提高。并通過實驗驗證該位點的AID突變效率顯著高于CHO?puro的隨機插入位點。

技術領域

本發明屬于生物醫藥及抗體工程領域，具體而言，涉及一種用于蛋白展示的細胞株及其制備方法和應用。

背景技術

目前，抗體已經被廣泛應用于科學研究、診斷和治療領域。而抗體被發現以后，抗體的親和力往往不高，這時就需要體外抗體展示技術來提高抗體的親和力從而使抗體得到應用。最近幾年，哺乳動物細胞抗體展示和體外高頻突變進化平臺已經得到快速發展。

在前期的工作中，申請人已經建立了一個哺乳動物細胞抗體進化平臺，將一個可替換的框式表達框隨機整合到CHO基因組中，通過多輪替換篩選鑒定獲得了一株單拷貝的細胞株CHO-puro(中國專利申請號：201410803422.2)。可以將抗體基因通過RMCE技術替換到基因組的預設位點，實現抗體的表達和展示。然后通過AID酶對抗體基因進行突變而獲得抗體突變庫，進而通過流式細胞儀進行分選獲得高親和力的抗體。但CHO-puro細胞株是通過隨機插入的方式獲得的，由于染色體的復雜性而不能保證該插入位點具有最好的轉錄水平和展示水平。

AID可以通過將胞嘧啶脫氨基轉換成尿嘧啶進而誘導成其他堿基突變。有研究報道在細菌及非B細胞內，AID也可以對高表達的基因進行高頻突變。AID的這種特質是哺乳動物細胞蛋白進化平臺的關鍵和基礎。目前有研究發現基因的轉錄水平和AID誘導的突變頻率成正比。因此如果能夠在基因組中找到一個高轉錄活性的位點，那么就能提高AID進化的效率，而且能夠提高抗體的展示水平，從而提高抗體進化平臺的整體效率。目前為止，這樣的高轉錄活性位點并不多，急需這方面的研究。因為之前基因定點插入的技術比較繁瑣復雜，研究這些位點比較困難。

染色體基因組中的基因整合位點對外源基因的轉錄水平，表達水平和穩定性起著至關重要的作用，這種現象被稱為位置效應。染色體結構比較復雜，能夠影響RNA聚合酶II的轉錄活性，并且染色體的動態結構受到多方面機制的調控，因此如何選擇這個基因高轉錄活性位點是比較困難的。

發明內容

一方面，本發明提供了一種可用于蛋白展示和表達的CHO細胞，所述CHO細胞的基因組中整合有表達框，所述表達框整合于CHO細胞基因組的YWHAE基因的終止密碼子之后的第1位至第2000位堿基區域的內部。

上述終止密碼子之后的堿基，應當理解為終止密碼子最后一位堿基之后的堿基，比如，終止密碼子為TGA，那么終止密碼子之后的第1位堿基應當為“TGA”中的堿基“A”之后的第1位堿基。假設TGA之后緊接的堿基序列為CTAAG……，那么上述堿基“C”即為終止密碼子之后的第1位堿基。

優選的，所述表達框整合于CHO細胞基因組的YWHAE基因的終止密碼子之后的第100位至第1900位堿基區域的內部，更優選，第500位至第1800位堿基區域的內部，更優選，第1000位至第1700位堿基區域的內部，更優選，第1200位至第1600位堿基區域的內部。

所述表達框包括啟動子、第一重組酶識別序列、目的基因、第二重組酶識別序列、終止子；優選的，所述表達框包括從5’到3’端依次連接的啟動子、第一重組酶識別序列、目的基因、第二重組酶識別序列和終止子。

進一步的，所述第一重組酶和第二重組酶選自重組酶Flpo或iCre。