[發明專利]一種提高臍帶血利用率的方法

有效

• 申請號: 201911365366.8
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN110982779B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 嵐山芮;魏偉;袁嘉恩
• 申請（專利權）人: 廣州市天河諾亞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/078
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發明公開一種提高臍帶血利用率的方法，所述包括以下步驟：(1)淋巴細胞分離液(ficoll)分離臍帶血；(2)提取單個核細胞：臍帶血在淋巴細胞分離液離心后，取體積比例為70～95％的白膜層上層液體分離單個核細胞；(3)制備內皮祖細胞外泌體：取剩下的白膜層液體，通過貼壁培養得到原代內皮祖細胞；分離的單個核細胞可誘導分化為巨核祖細胞，內皮祖細胞擴增培養后可進一步制備內皮祖細胞外泌體；本發明的制備方法可以充分利用同一份臍帶血資源，制備過程簡單可靠，重復性好，不易受污染，兼顧了制備成本的經濟性和操作安全性，對臨床治療有積極意義，具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于細胞生物學、分子生物學及藥物研發技術領域，具體涉及提高臍帶血利用率的方法。

背景技術

臍帶血是胎兒娩出、臍帶結扎并離斷后殘留在臍靜脈中的血液，1970s的研究發現，臍帶血中含有豐富的造血干細胞，可以重建人體造血和免疫系統，1989年世界首例臍帶血造血干細胞移植成功后，各國科學家經過30年的探索和發展，目前臍帶血可以治療80多種疾病。因此，臍帶血造血干細胞已成為重要的生物醫學資源，相對于骨髓造血干細胞，臍帶血造血干細胞對供者無創，免疫原性低，而且是實體儲存，不會產生悔捐等嚴重影響臨床治療的情況，因此具有巨大的醫學價值。但目前同一份臍帶血，通常用于單一制備用途，如MKPC或者MNC或者整份進行移植等，利用率低，遠不能滿足日益多樣的臨床治療需求。

由于臍帶血造血干細胞可以構建血液細胞的全體系，因此深入挖掘不同細胞的差異，進行分別誘導區別培養等綜合利用，從而更充分利用臍帶血這一寶貴的生物醫學資源，更充分地轉化為臨床治療的有效制劑，有直接的醫學意義。

發明內容

本發明的目的在于針對上述現有技術的不足之處而提供一種提高臍帶血利用率的方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種提高臍帶血利用率的方法，包括以下步驟：

(1)臍帶血處理：取臍帶血，加入淋巴細胞分離液進行離心分離；

(2)提取單個核細胞：取體積為白膜層70～95％的白膜層上層液體，離心分離得到其中的單個核細胞；

(3)制備內皮祖細胞：取剩下的分層液，離心后收集其中的細胞，重懸于內皮祖細胞培養基中，進行原代培養得到內皮祖細胞。

Ficoll是蔗糖的多聚體，平均分子量為400,000，當密度為1.2g/mL仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜，Ficoll密度梯度離心法，可用來分離人臍帶血單個核細胞(MNC)，臍帶血MNC含有臍帶血造血干細胞(HSC)等豐富的干/祖細胞。紅細胞離心后沉于管底；淋巴細胞以及其他單個核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后位于分層液的液面上，形成白膜層，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取白膜層的細胞，就可分離到單個核細胞。操作技術良好的狀態下，抽取用于誘導培養的單個核細胞(MNC)的白膜層上層液體，極限值為95％。

在利用Ficoll分離制備單個核細胞時，為了避免提取體積混雜下層分層液體影響后續培養(單個核細胞分為懸浮細胞，下層分層液體的雜質成分會干擾懸浮細胞培養)，抽取白膜層時僅抽取白膜層的上層液體，不會抽取白膜層的全部液體，剩下的少量白膜層通常廢棄；這對于寶貴的臍帶血來說是一種浪費。本發明將這部分的通常被廢棄的白膜層液體用于培養內皮祖細胞，有效增加了臍帶血的綜合利用的程度，對臨床治療提供了更大的支持。

作為本發明的優選實施方式，所述步驟(2)中取體積為白膜層70～80％的白膜層上層液體分離單個核細胞。

僅取白膜層總體積的70～80％即可有效分離單個核細胞，操作簡便快捷，對精細程度要求不高，保證了批量生產過程的高效率。