[發(fā)明專利]一種提高臍帶血利用率的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911365366.8
• 申請(qǐng)日: 2019-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN110982779B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嵐山芮;魏偉;袁嘉恩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市天河諾亞生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/078
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

1.一種提高臍帶血利用率的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）臍帶血分離處理：取臍帶血，加入淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行離心分離；

（2）提取單個(gè)核細(xì)胞：取體積為白膜層70~95%的白膜層上層液體，再離心分離得到其中的單個(gè)核細(xì)胞；

（3）制備內(nèi)皮祖細(xì)胞：取剩下的白膜層分層液，收集其中的細(xì)胞，重懸于內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基中，進(jìn)行原代培養(yǎng)得到內(nèi)皮祖細(xì)胞；

所述步驟（3）中內(nèi)皮祖細(xì)胞的制備方法為：將取得的白膜層細(xì)胞接種于內(nèi)皮祖細(xì)胞原代培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)四天，第五天更換培養(yǎng)基；以后每3天更換培養(yǎng)基，并觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞集落的生長(zhǎng)情況，單個(gè)集落的細(xì)胞數(shù)大于1000個(gè)，即進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

所述內(nèi)皮祖細(xì)胞原代培養(yǎng)基為含有EGM-2MV的EBM培養(yǎng)基。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中取體積為白膜層70~80%的白膜層上層液體分離單個(gè)核細(xì)胞。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中臍帶血處理的具體方法為：臍帶血在采集后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，輕緩地加到淋巴細(xì)胞分離液的液面上，所述臍帶血與所述淋巴細(xì)胞分離液體積比為2：1，800g離心20分鐘。

4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，將所述步驟（2）的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，分化為巨核祖細(xì)胞；所述巨核祖細(xì)胞的制備方法為：將所述單個(gè)核細(xì)胞接種于巨核祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)7天，在第4天加入50%原始體積的巨核祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

所述巨核祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Stemspan培養(yǎng)基，所述Stemspan培養(yǎng)基含有如下組分：15 μmol/L白黎蘆醇、20 ng/mL IL-3、40 ng/mL IL-6、50 ng/mL SCF和40 ng/mL TPO。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟（4）制備內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體：擴(kuò)增培養(yǎng)步驟（3）的內(nèi)皮祖細(xì)胞，收集培養(yǎng)基中的內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體；

所述步驟（4）中內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體的制備方法為：取傳代培養(yǎng)至第四代的內(nèi)皮祖細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后加入IL-8并使其終濃度為12ng/mL，再培養(yǎng)72小時(shí)；收集培養(yǎng)基，通過超高速離心即得到所述內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體。