[發(fā)明專利]一種促進(jìn)N-乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)的RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911361421.6
• 申請(qǐng)日: 2019-12-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110885364B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉龍;鄧琛;盧健行;劉長(zhǎng)峰;盧建功;李江華;堵國(guó)成;陳堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);山東潤(rùn)德生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/34
• 分類號(hào): C07K14/34;C12N15/31;C12N1/21;C12N15/77;C12P19/26;C12R1/15
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 郭磊

本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)N?乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)的RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明的突變體是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的親本上，將90位的賴氨酸突變?yōu)樘於０罚约皩?2位的絲氨酸突變?yōu)橘嚢彼?。本發(fā)明提供了一種促進(jìn)N?乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)的RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體，并提供了過(guò)表達(dá)RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體，能提高N?乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的基因工程菌株，通過(guò)過(guò)表達(dá)參與碳代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子RamA，提高了N?乙酰氨基葡萄糖在胞外的積累量，其濃度最高可達(dá)31.5g/L，為進(jìn)一步代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組谷氨酸棒桿菌構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種促進(jìn)N-乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)的RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體及其應(yīng)用，屬于代謝工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是氨基葡萄糖的一種衍生物，具有還原性，也是合成雙岐因子和透明質(zhì)酸的重要前體物質(zhì)，又稱2-(乙酰氨基)-2-脫氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物體內(nèi)多種多糖的基本組成單位，在生物體內(nèi)具有重要的生理功能。谷氨酸棒桿菌是放線菌門中高GC含量的革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌，已被用于氨基酸的工業(yè)生產(chǎn)，并被設(shè)計(jì)用于生產(chǎn)各種化合物，包括聚合物結(jié)構(gòu)單元和生物燃料。自其基因組序列首次發(fā)表以來(lái)，其多功能代謝途徑及其遺傳成分和調(diào)控機(jī)制已得到廣泛研究。為了提高生物技術(shù)生產(chǎn)的效率，基于基因組序列信息開(kāi)發(fā)了遺傳工具和基于組學(xué)的分析方法，包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝組學(xué)和流變學(xué)，并廣泛用于了解代謝途徑及其在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。

在過(guò)去的研究中，為了提高谷氨酸棒桿菌中目標(biāo)基因的表達(dá)量，學(xué)者們往往采用基因組改造、啟動(dòng)子以及RBS序列的優(yōu)化、利用定點(diǎn)突變技術(shù)以及改造轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等方式。要想實(shí)現(xiàn)真正意義上的工程菌株的定性改造和細(xì)胞工程的理性設(shè)計(jì)，必須從細(xì)胞整體和系統(tǒng)全局出發(fā)，綜合考慮基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及代謝反應(yīng)之間的相互作用關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種促進(jìn)N-乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)的RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體，使得谷氨酸棒桿菌中的碳代謝流更多地流向N-乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)，從而提高了谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的能力，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種促進(jìn)N-乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)的RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體，所述突變體是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的親本上，將90位的賴氨酸突變?yōu)樘於０?，以及?2位的絲氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷?/p>

進(jìn)一步地，所述的親本的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步地，所述的RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

進(jìn)一步地，所述的RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種提高N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的基因工程菌，所述基因工程菌是以谷氨酸棒桿菌為宿主菌，過(guò)表達(dá)RamA轉(zhuǎn)錄因子突變體。

進(jìn)一步地，所述的宿主菌為谷氨酸棒桿菌S9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh。

進(jìn)一步地，所述的基因工程菌是以pTYW-4-ceN-C.glglmS為表達(dá)載體。表達(dá)載體pTYW-4-ceN-C.glglmS具體構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn)文獻(xiàn)——Chen Deng,Xueqin Lv,Yanfeng Liu,Long Liu.Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum S9114 based onwhole-genome sequencing for efficient N-acetylglucosamine synthesis.Syntheticand Systems Biotechnology,2019.4:120-129。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：