[發明專利]DNA及RNA同時檢測的基因變異位點檢測方法

在審

• 申請號: 201911358465.3
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN110938680A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發明（設計）人: 夏秦冬;孫愛娟;喬巖;孫玉龍;王弢
• 申請（專利權）人: 江蘇為真生物醫藥技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于PCR擴增的高靈敏的基因變異位點檢測方法，其特征在于：通過對樣品中包含目標變異位點的DNA和RNA的共擴增實現。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，包括針對目標變異位點設計DNA和RNA的共擴增引物的設計步驟，該共擴增引物的設計方法為：

a：變異位點附近無內含子或距內含子較遠，能在同一外顯子上完成引物設計時，在同一外顯子上完成引物設計；

b：變異位點附近存在內含子，不能在同一外顯子上完成引物設計，且相鄰的內含子長度較短，內含子長度小于約120bp時，在相鄰外顯子上完成引物對的設計，結果是DNA擴增子中包含一段長度較短的內含子，RNA擴增子中不含內含子；

c：變異位點附近存在內含子，不能在同一外顯子上完成引物設計，且相鄰的內含子長度較長，內含子長度大于約120bp時，在變異位點所在外顯子上完成通用上游或通用下游引物的設計，在相鄰內含子上完成DNA擴增所需下游或上游引物的設計，在相鄰外顯子上完成RNA擴增所需下游及上游引物的設計，結果是DNA擴增子包含部分相鄰內含子，RNA擴增子包含部分相鄰外顯子。

3.根據權利要求1或2所述的檢測方法，所述樣本類型為體液。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，所述體液選自：血漿、血清、尿液等。

5.根據權利要求1-4任一項的檢測方法，其特征在于：擴增子長度小于約150bp或約140bp或約130bp或約120bp或約90bp。

6.一種同時擴增DNA及RNA的體系，包括了根據權利要求2-5任一項方法設計的同時擴增DNA及RNA的引物對。

7.根據權利要求6的體系，所述體系中還包括PCR緩沖液、dNTPs、二氯化鎂、DNA聚合酶、逆轉錄酶。

8.根據權利要求7的體系，所述體系中還包括阻滯探針。

9.根據權利要求6-8任一項所述的體系，所述體系中還包括UDG酶、dUTP。

10.適合于權利要求6-9任一項所述體系的反應程序，所述反應程序包括UDG酶與逆轉錄酶在合適溫度下同時反應的步驟。

11.根據權利要求10所述的反應程序，所述同時反應的步驟具體為：50-55℃ 5-15min。

12.一種高靈敏基因變異位點檢測試劑盒，包括PCR緩沖液、dNTPs、二氯化鎂、DNA聚合酶、其特征在于還包括根據權利要求2-6任一項方法設計的同時擴增DNA及RNA的引物對，還包括逆轉錄酶。

13.根據權利要求12的試劑盒，所述試劑盒中還包括相應的阻滯探針。

14.根據權利要求12的試劑盒，所述試劑盒中還包括UDG酶、dUTP。