[發明專利]一種提高人凝血因子IX表達水平的方法

在審

• 申請號: 201911355010.6
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN111647625A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 姜舒;熊斌;張蕓
• 申請（專利權）人: 深圳三智醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864
• 代理公司: 廣州瑞之凡知識產權代理事務所(普通合伙) 44514
• 代理人: 鄒俊煊

本發明公開了一種提高人凝血因子IX表達水平的方法，包括優化人凝血因子IX基因；替換Kozak序列；利用優化后的人FIX基因和Kozak序列構建腺相關病毒(AAV)表達質粒并包裝重組AAV；本發明使用優化后的基因編碼序列和Kozak序列，顯著地提高了人凝血因子FIX基因的表達水平。該優化的人FIX基因和Kozak序列可用于高效生產治療B型血友病的FIX蛋白，降低FIX蛋白的生產成本；也可用于AAV介導的基因替代療法治療B型血友病，提高FIX基因在人體內的表達水平，從而減少給藥劑量，提高治療效果。

技術領域

本發明涉及生物化學領域，具體涉及一種通過優化編碼基因的 Kozak序列和密碼子提高重組人凝血因子FIX表達水平的方法

技術背景

B型血友病是一種X染色體連鎖的遺傳性血液疾病。患者X染色體上編碼凝血因子IX的FIX基因發生突變，而導致不能正常合成凝血因子IX。在臨床上表現為凝血時間延長，嚴重時自發出血，有致畸致殘的風險，甚至危及生命。目前主要依靠補充有活性的凝血因子IX 進行替代治療，需要終身給藥，尚無治愈方法。

人凝血因子IX的編碼基因位于X染色體上，全長33.5kb，包含 8個外顯子和7個內含子；mRNA全長2802bp；凝血因子IX由461 個氨基酸組成，其中包括N端一段28個氨基酸的信號肽，介導FIX 蛋白分泌到血液；FIX蛋白在人體血液中的半衰期約為24h。

正常人血漿中FIX蛋白的濃度約為5mg/L。當人血漿中FIX蛋白的濃度為正常濃度的5-40％時，表現出輕度血友病癥狀，在大手術時可能會導致嚴重出血；當人血漿中FIX蛋白的濃度為正常濃度的1-5％時，表現出中度血友病癥狀，在小手術或遭遇外傷時可能會導致嚴重出血；當人血漿中FIX蛋白的濃度低于正常濃度的1％時，表現出重度血友病癥狀，會出現自發出血。長期的自發出血可能導致關節畸變或者殘疾，顱內出血甚至會危及生命。

B型血友病在男性中的患病率約為1/25000，尚無治愈方法，目前治療該病的方法主要有兩種：1)輸血補充患者血漿中的FIX。該方法給輸血者帶來了血液傳染病的風險，并且長期輸血會導致鐵元素在體內的積累。2)注射重組人源FIX蛋白，該方法的給藥周期為1-3 次/周，治療成本較高，給患者帶來了較大的經濟負擔。

為彌補現有技術的不足，本發明的目的在于開發一種提高重組人源FIX蛋白體外表達水平的方法，利用體外重組人源蛋白治療B型血友病，既可避免長期輸血帶來的血液傳染病風險，又可降低重組人源 FIX蛋白的生產成本，也可用于B型血友病的基因治療，具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：對人FIX基因進行密碼子優化，將人FIX基因原有的Kozak序列替換成一段更加高效的 Kozak序列，并利用以上AAV表達載體包裝重組AAV。

進一步，所述優化后的Kozak序列為GCCGCCACCATGC，其中加粗的ATG為FIX基因的起始密碼子。

進一步，所述人FIX基因去除了除第一個內含子Intron I以外的其它內含子，保留了所有8個外顯子。

進一步，所述優化后的FIX基因序列如下Seq1所示。

Seq1：FIX基因序列