[發明專利]一種提高人凝血因子IX表達水平的方法

在審

• 申請號: 201911355010.6
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN111647625A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 姜舒;熊斌;張蕓
• 申請（專利權）人: 深圳三智醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864
• 代理公司: 廣州瑞之凡知識產權代理事務所(普通合伙) 44514
• 代理人: 鄒俊煊

1.一種提高人凝血因子IX表達水平的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，對IX基因進行密碼子優化。

步驟2，替換Kozak序列，所述替換后的Kozak序列為GCCGCCACCATGC，其中的ATG為IX基因的起始密碼子；使用所述Kozak序列表達優化后的IX基因。

步驟3，制備重組腺相關病毒rAAV，質粒轉染或者rAAV感染HEK293T或HepG2細胞。

2.根據權利要求1所述的一種提高人凝血因子IX表達水平的方法，所述制備重組腺相關病毒rAAV，質粒轉染或者rAAV感染HEK293T或HepG2細胞

1)酶切反應體系為：

DNA 1μg

10×Buffer 5μL

Notl限制性內切酶1μL

ddH₂O補充至50μL

反應條件為：

37℃，1-16h

2)片段回收：將酶切后的反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖濃度為1％。電泳參數為：電壓120V，時間30min。在紫外光下切下目標片段；利用膠回收試劑盒回收目標DNA；利用微型分光光度計檢測所回收DNA濃度；

3)連接

連接反應體系為：

線性化AAV載體100ng

線性化FIX表達序列適量，為線性化AAV載體mol量的3-10倍10×T4 DNA ligaseBuffer 1.5μL

T4 DNA ligase 1μL

ddH₂O補充至15μL

反應條件為：16℃，4-16h

4)轉化E.coli Stbl4化轉感受態細胞

取一管凍存于-80℃的E.coli Stbl4化轉感受態細胞(100μL)，放入冰中融化，加入上述連接反應液10μL；輕彈管壁使其混勻，冰浴30min，42℃熱激45s，冰浴2min，加入1mL LB培養基；200rpm復蘇30-60min，取適量菌液涂布到含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養約16h；

5)質粒鑒定

挑取LB平板上的菌落接種到含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養中，利用PCR的方法進行初步鑒定，鑒定引物序列如下：

上游引物(seqF)：TAGTCCTGTCGGGTTTCG

下游引物(seqR)：TACAGGGCGCGTACTATG

PCR反應體系為：

EasyTaq 2×Mix 10μL

seqF(10μM)1μL

seqR(10μM)1μL

菌液1μL

ddH₂O 7μL

總體積20μL

PCR反應程序為：

95℃10min

94℃30s

58℃30s

72℃60s

第2步至第4步反應35個循環

72℃2min

PCR反應結束后，利用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定；電泳的電壓為120V，時間為30min；電泳結束后，利用紫外凝膠成像儀觀察電泳結果；選取PCR條帶大小為4419bp的菌落，進一步進行測序驗證，最終獲得目標質粒。