[發明專利]一種大熊貓犬瘟熱病毒的異源抗體及其制備方法

有效

• 申請號: 201911354898.1
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN110950950B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 趙玄多;張躍;武英利;楊維維;李麗;張玉新;張子佳;劉靜;史明;朱明媛;王溪;黃韜;王曉輝;谷孝玉;李潤;梁先紅
• 申請（專利權）人: 唐山怡安生物工程有限公司;楊凌博德越生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 方挺;黃謙

1.一種大熊貓犬瘟熱病毒的馬源抗體的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)對大熊貓犬瘟熱病毒強毒株進行擴增，建立免疫用疫苗制備毒株:

①大熊貓犬瘟熱病毒毒株種子批的制備:

a原始種子批的制備

具體方法為將大熊貓犬瘟熱病毒毒株,其保藏編號為CGMCCNo.18179，按0.5％接種在單層的Vero細胞上，在37℃進行病毒培養，培養至細胞病變達到80％～90％時收獲病毒上清液，代次為1代，以此類推，將大熊貓犬瘟熱病毒毒株第9代按0.1M.O.I.接種到攪拌瓶中，懸浮培養96h，待細胞病變達到80％～90％時收獲病毒液，定量分裝，凍干，制成第10代原始種子批；

b基礎種子批的制備

待微載體上培養的細胞長成單層，將大熊貓犬瘟熱病毒毒株第10代原始種子按0.1M.O.I.接種到攪拌瓶中，懸浮培養96～120h，待細胞病變達到80％～90％時收獲病毒液,按照上述方法將毒株進行傳代，制成第14和16代毒株，并進行病毒含量和免疫抗原性檢驗；

c生產用種子批的制備

待微載體上培養的細胞長成單層，將大熊貓犬瘟熱病毒毒株第14代和16代基礎毒種按0.1M.O.I.接種到攪拌瓶中，懸浮培養96～120h，待細胞病變達到80％～90％時收獲病毒液，制成17和19代毒株，并進行病毒含量和免疫原性檢驗；

將上述制備的原始種子批、基礎種子批和生產種子批用于疫苗的制備；

②Vero細胞的制備

取第130代Vero細胞工作種子速溶后，用含10％新生牛血清的MEM培養基接種到T25細胞培養瓶中，37±0.5℃條件下培養24h，更換含5％新生牛血清的MEM培養基，繼續培養7日，待長成單層后，以相同的方法進行細胞傳代,將長成單層的Vero細胞用細胞消化液消化，接種到生物反應器中，細胞接種濃度為0.40×10⁶個/ml，微載體濃度為6.0g/L，加入含10％新生牛血清的MEM細胞生長液至工作體積，在溫度37±0.5℃，pH為7.20±0.05條件下培養待用,

③犬瘟熱病毒滅活疫苗的制備

以Vero細胞為細胞基質，以犬瘟熱病毒為毒株，在攪拌瓶或生物反應器中進行病毒培養；在生物反應器中待細胞長成單層后，按0.1MOI接種病毒，培養溫度為37±0.5℃，pH為7.20±0.05條件下，含0.2％牛血清蛋白的MEM病毒維持液，培養至120h，且待細胞病變CPE達80％～90％時收獲病毒上清液，取樣進行病毒含量測定，病毒含量達10^7.5TCID₅₀/0.1ml,

④疫苗制備步驟如下：

將犬瘟熱病毒收獲液采用0.65μm濾芯澄清過濾去除細胞碎片，過濾后的犬瘟熱病毒毒株收獲液采用截留分子量為300KDa膜包被超濾濃縮10倍，將犬瘟熱病毒毒株濃縮液加入終濃度為1/4000的β-丙內酯，置2～8℃條件下滅活24h，37±0.5℃水解2h，按佐劑：犬瘟熱滅活疫苗原液＝1:3的比例加入帕米卡佐劑，制備免疫原；

(2)對健康馬匹在背部皮下分點注射進行免疫，獲得大熊貓犬瘟熱高免疫血清，

(3)對所述血清抗體進行純化處理，獲得精制馬源抗體F(ab’)2；

具體方法為：無菌條件下將1體積高免疫血清與2體積無熱原水進行混合，1M HCl調pH至3.4，然后，向稀釋血清中加入終濃度為10000IU/mL胃蛋白酶，混勻后30℃消化2.5h，期間不斷攪拌，經過酶切處理后先用NaOH調節pH至4.5，之后緩慢加入硫酸銨至終濃度為12％(w:v)；除去產生的沉淀后，在56℃下對酶解液進行1h的熱變性處理，隨后，上清通過30℃的冷水對流冷卻處理，接著去除掉隨之產生的沉淀，調節上清pH至7.0，加硫酸銨至終濃度23％(w:v)以沉淀F(ab’)2，用0.01M PBS重溶F(ab’)2并進行超濾，除掉剩余硫酸銨并濃縮，添加NaCl、防腐劑與一些賦形劑，再次調節pH至中性，經0.22μm濾膜過濾除菌分裝，獲得的F(ab’)2經30KD膜包超濾濃縮置換至pH7.2的0.01M PBS中，室溫下，Sephacryl-100以相同緩沖液平衡3個柱體積后上樣，上樣后，以pH7.2的0.01M PBS持續洗滌柱子，同時檢測OD280數值變化并分段收集流穿液，經9％濃度分離膠的非還原SDS-PAGE鑒定后，合并含有絕大多數F(ab’)2成分的流穿液，經30KD MWCO超濾管進行濃縮，獲得精制的純化馬源大熊貓犬瘟熱病毒抗體。

2.如權利要求1所述的制備方法，其中所述馬匹為1歲齡的幼齡馬匹，不曾患過任何傳染性疾病的馬匹。