[發明專利]具有去除宿主基因組DNA功能的微生物核酸提取方法以及試劑盒

在審

• 申請號: 201911352458.2
• 申請日: 2019-12-25
• 公開（公告）號: CN111057747A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 黃超杰;魯津津;崔望
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

本發明公開了具有去除宿主基因組DNA功能的微生物核酸提取方法以及試劑盒。本發明提供了成套引物對，包括1個或多個引物對，每個所述引物對對應擴增宿主基因組DNA中的1個高度重復序列；所述高度重復序列任選自如下基因家族中至少一種基因，所述基因家族包括MIR家族基因和/或ALu家族基因。本發明提供的具有去除宿主基因組DNA功能的微生物DNA提取方法富集微生物基因組DNA效果更強，本發明是在裂解釋放核酸步驟后去除宿主基因組DNA，然后再富集微生物基因組DNA進行純化回收，同時還可以富集宿主細胞內部的病毒核酸，不改變宏基因組菌群結構。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種具有去除宿主基因組DNA功能的微生物核酸提取方法以及試劑盒。

背景技術

宏基因組學(Metagenomics)又叫微生物環境基因組學、元基因組學，它主要是通過直接從環境樣品中提取全部微生物的基因組DNA構建基因組文庫，利用基因組學的研究策略研究環境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能，隨著新一代測序技術的迅猛發展，宏基因組學的研究已經應用到各個領域，近幾年尤其是在臨床醫學領域包括感染性疾病診斷、病原藥敏、傳染病疫情、流行病學等，有力推動感染性疾病精準醫學發展，提高臨床感染性疾病診療水平。

當前在利用高通量測序在面對復雜臨床樣品如感染血液、唾液和呼吸道樣本時，由于微生物基因組相對于宿主人的基因組小太多，如果采用傳統的核酸提取方法進行基因組核酸提取純化時，提取得到微生物基因組在提取得到的總核酸中所占比例很小，僅占到1％-6％,測序得到的Reads數大部分為宿主人的基因組序列，為提高病原體基因組足夠的序列覆蓋度，往往需提高測序的深度，造成了大量的不必要的測序數據浪費，這也是目前臨床上未知病原檢測成本居高不下的主要原因。

目前市面上針對于血液、唾液、咽拭子等臨床樣品的微生物核酸的提取方法主要包括磁珠法、吸附柱法和傳統的酚/氯仿抽提法，這些方法和試劑盒大部分不具備去除宿主基因組DNA的功能，只有少數幾款產品和專利涉及到了去除宿主基因組DNA功能。Qiagen公司提供一款細菌基因組DNA提取試劑盒，即QIAamp DNA Microbiome Kit，該產品采用化學和物理方法裂解細胞，可以從拭子和體液中純化和富集細菌微生物DNA，在純化的過程中高效的去除宿主DNA，適用于基于16s讓DNA的高靈敏度微生物組分析和宏基因組鳥槍法測序。廣州美基生物科技有限公司有一款針對于血液樣品細菌DNA提取試劑盒(貨號：D3148-02)，該產品同樣是基于化學試劑針對于微生物與宿主細胞之間的滲透壓差的原理差異性的裂解宿主細胞釋放宿主DNA，實現宿主基因組DNA與微生物基因組之間的分離。2014年中國科學院北京基因組研究所與北京大學人民醫院授權了一篇專利《宏基因組提取方法》(專利授權號：CN103060309B)，該專利公開了一種利用探針雜交磁珠捕獲方式降低宿主宏基因組DNA樣品中的宿主DNA的方法，該方法主要是利用宿主DNA中重復序列Alu序列作為單向或雙向探針，利用生物素修飾探針和使用包被鏈霉親和素的磁珠捕獲與探針雜交的宿主DNA，從而達到減弱宏基因組中宿主DNA背景、提高測序數據有效率的目的。

但是Qiagen公司的QIAamp DNA Microbiome Kit與美基生物的血液中富集細菌DNA提取試劑盒(D3148-02)都是化學試劑優先裂解和釋放宿主基因組DNA的原理實現去除宿主基因組DNA的目的，但是由于細菌種類的多樣性，很難保證化學試劑釋放宿主基因組DNA時對樣本中微生物群落結構不產生影響，同時樣本中的DNA病毒和RNA病毒等微生物大部分是以整合到宿主基因組中或游離在宿主細胞質的形式存在，在去除宿主基因組DNA的同時將病毒基因組DNA和RNA一并去除。該方法不能提取樣本中病毒DNA和RNA，使得這類產品在宏基因組研究中往往漏檢病毒類病原體，實用性大打則扣，因此僅僅利用化學方法和物理方法很難實現去除宿主基因組DNA的同時將宏基因組DNA全部保留的目的。