[發(fā)明專利]一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911343853.4
• 申請(qǐng)日: 2019-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN110885817A
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀亭亭;邢錦城;洪立洲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N5/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。以田菁黃化苗為材料，優(yōu)化操作后獲得的田菁組織提取液通過調(diào)整后的轉(zhuǎn)速離心去除雜質(zhì)，分離并富集粗制的線粒體，經(jīng)過蔗糖梯度離心法對(duì)線粒體進(jìn)行純化，再次通過離心富集純化后的線粒體。利用改良后的SDS法提取的線粒體DNA其A260/A280約為1.80～1.88，限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切后條帶清晰，說明本方法提取的線粒體DNA純度高。利用該發(fā)明所公開的方法能夠簡單快捷的提取到純凈的田菁線粒體DNA，為田菁線粒體基因組及其內(nèi)部基因的分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及田菁線粒體及其DNA的有效提取方法，適用于田菁線粒體及其DNA的分離純化。

二、背景技術(shù)

線粒體是半自主細(xì)胞器，在真核生物中，通過氧化磷酸化過程為細(xì)胞提供ATP。線粒體基因組具有進(jìn)化緩慢、序列插入缺失頻繁、重組迅速、結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣和基因表達(dá)模式獨(dú)特等特點(diǎn)(Schuster and Brennicke 1994；Sanchez Puerta et al.2017；Kovar etal.2018；Sanchez Puerta et al.2019；Zhang et al.2019)。植物線粒體基因組的大小變化范圍較大，從187kb到2400kb均有分布(Bentolila and Stefanov，2012)。線粒體與細(xì)胞核、質(zhì)體之間的序列交換及其自身重復(fù)序列的含量對(duì)線粒體基因組大小影響很大(Sternand Lonsdale 1982；Vaughn et al.1995；Goremykin et al.2012；Christensen 2014；Wynn and Christensen 2019)。植物在有氧呼吸過程中，葡萄糖通過糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化在線粒體中釋放能量。但在無氧環(huán)境中，細(xì)胞則會(huì)在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中進(jìn)行無氧呼吸，糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸不再進(jìn)入線粒體進(jìn)行三羧酸循環(huán)。除了合成ATP為細(xì)胞提供能量等主要功能外，線粒體還能通過調(diào)節(jié)膜電位控制細(xì)胞程序性死亡。

田菁作為一種豆科植物，根系發(fā)達(dá)，鮮草產(chǎn)量高且養(yǎng)分豐富，已成為一種優(yōu)良的夏季綠肥和動(dòng)物飼料(徐開未等，2014；黃志武和廖紅1992)。此外，田菁的莖稈纖維可用于造紙，種子可用于生產(chǎn)田菁膠(焦彬等1986)。近期的研究表明，田菁葉片中的新型半胱氨酸酶可能在止血和傷口愈合過程中發(fā)揮作用(Shivamadhu et al.2017)。因此田菁具有較高的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，田菁在澇脅迫環(huán)境中根部能夠形成海綿狀通氣組織，生物量增加，結(jié)瘤能力增強(qiáng)。在此過程中田菁根部線粒體的呼吸作用是否受到影響，是否存在種屬特異基因響應(yīng)澇脅迫還未知。田菁線粒體及其高純度DNA的提取能夠?yàn)楹笃谘芯康於ɑA(chǔ)。

三、發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明的目的是公開一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法，該方法適用于田菁線粒體及其DNA的分離純化。為了獲得純化的線粒體，對(duì)田菁種子進(jìn)行暗培養(yǎng)，以減少葉綠體的產(chǎn)生，通過差速離心法去除植物組織雜質(zhì)和細(xì)胞核，獲得粗制的線粒體，采用蔗糖密度梯度和超速離心相結(jié)合的方式去除與線粒體沉降系數(shù)相近的質(zhì)體，分離得到純化的線粒體。想要得到高純度的線粒體DNA，需要去除細(xì)胞核和質(zhì)體中的DNA還有組織中的RNA。利用差速離心和DNase消化相結(jié)合的方式去除游離的和結(jié)合在線粒體膜上的DNA。在對(duì)純化的線粒體破壁提取DNA的過程中，RNase的加入和3h的水浴能夠很好的去除RNA的干擾。本發(fā)明結(jié)合不同植物線粒體DNA的提取方法和不斷的試驗(yàn)摸索，對(duì)組織破碎方式、勻漿緩沖液和DNA提取緩沖液組分、差速離心組合進(jìn)行了調(diào)整，結(jié)合蔗糖密度梯度離心法獲取高純度的線粒體及其DNA。本發(fā)明具有操作簡便，成本低廉，產(chǎn)物純度高的特點(diǎn)，為田菁線粒體基因組的研究奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)方案

本發(fā)明基于試驗(yàn)摸索改良過后的組織勻漿緩沖液組分和差速離心組合，結(jié)合蔗糖密度梯度和超速離心獲取純化的線粒體，后經(jīng)改良的DNA提取緩沖液，實(shí)驗(yàn)獲得高純度的線粒體DNA。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：

1、田菁組織勻漿液的獲取：