[發明專利]一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法

在審

• 申請號: 201911343853.4
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN110885817A
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 賀亭亭;邢錦城;洪立洲
• 申請（專利權）人: 江蘇沿海地區農業科學研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N5/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)將田菁種子進行暗培養，需要照明時使用綠光燈，利用研磨緩沖液將定量田菁黃化苗破碎，先后通過紗布和尼龍網過濾獲得組織勻漿液；

2)勻漿液通過差速離心去除組織碎片和細胞核，利用DNase I去除線粒體溶液中DNA，獲得粗制線粒體；

3)粗制線粒體利用緩沖液重懸后，轉移至由蔗糖鋪成的不連續密度梯度液上，經過超高速離心，獲得純化的線粒體；

4)利用改良的SDS方法提取線粒體DNA，獲得無蛋白和RNA污染的高純度DNA；

5)對提取的田菁線粒體DNA進行濃度檢測、電泳條帶檢測和純度檢測。

2.根據權利要求1所述的一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步驟1)中，由于苗期生長速度的限制，采用培養2周的田菁作為線粒體提取材料，包括上下胚軸和葉片；在研磨緩沖液中加入半胱氨酸和β-巰基乙醇，降低線粒體的氧化損傷；勻漿液先用2層無菌的脫脂紗布過濾，再用2層100目的尼龍網過濾，在冰上收集濾液。

3.根據權利要求1所述的一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步驟2)中，勻漿液在高速離心機中離心15min，轉速2200g；將上清液再次高速離心15min，轉速17000g；向沉淀中加入緩沖液和DNase I至其濃度為50μg/mL，冰浴1h加入EDTA終止反應；高速離心20min，轉速18000g，獲得粗制線粒體。

4.根據權利要求1所述的一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步驟3)中，將線粒體沉淀重懸于緩沖液中，轉移至由5mL 1.45M和5mL 1.2M蔗糖鋪成的不連續密度梯度液上；超高速離心機離心90min，轉速20600rpm；收集蔗糖梯度溶液之間的線粒體；高速離心機離心20min，轉速20000g，沉淀即為純化的線粒體。

5.根據權利要求1所述的一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步驟4)中，向純化的線粒體中加入裂解緩沖液，按照體系將蛋白酶K、SDS、RNase加入后37℃水浴3h，冷卻至室溫加入NH4AC溶液，之后按照常規提取DNA的方法將蛋白抽提干凈，無菌水溶解保存獲得高純度線粒體DNA。

6.根據權利要求1所述的一種田菁線粒體及其DNA提取的有效方法，其特征在于：步驟5)中，利用酶標儀檢測田菁線粒體DNA的濃度和純度，瓊脂糖(1％)凝膠電泳檢測DNA的完整性，利用限制性內切酶EcoR I進行酶切，檢測線粒體DNA的純度。