[發(fā)明專利]一種調(diào)控多粘菌素B同系物組分的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201911341235.6 | 申請日： | 2019-12-23 |
| 公開（公告）號： | CN111041037B | 公開（公告）日： | 2022-08-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 程景勝;袁野;元英進(jìn) | 申請（專利權(quán)）人： | 天津大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/66 | 分類號： | C12N15/66;C12P21/04;C07K7/62;C12R1/01 |
| 代理公司： | 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201 | 代理人： | 曹玉平 |
| 地址： | 300350 天津市津南區(qū)海*** | 國省代碼： | 天津;12 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 調(diào)控 多粘菌素 同系物 組分 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種調(diào)控多粘菌素B同系物組分的方法，包括如下步驟：(1)構(gòu)建pMAD?△A和pMAD?△C，(2)將pMAD?△A轉(zhuǎn)化菌株CJX518，篩選，得到轉(zhuǎn)化成功的菌株，再培養(yǎng)傳代得到質(zhì)粒丟失菌株，通過PCR測序驗(yàn)證為結(jié)構(gòu)域替換菌株518?A；再將pMAD?△C轉(zhuǎn)化菌株518?A，篩選，培養(yǎng)傳代得到質(zhì)粒丟失菌株，通過PCR測序驗(yàn)證為結(jié)構(gòu)域替換菌株518?AC；(3)種子培養(yǎng)，得到二級種子；(4)多粘菌素B生產(chǎn)：將二級種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵72小時(shí)。本發(fā)明的方法調(diào)控多粘菌素B的同系物組分，增加了B1與B2的比例，降低了B3與B1?1的比例。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物與新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種調(diào)控多粘菌素B的同系物組分的方法。
背景技術(shù)
多粘菌素B對超級細(xì)菌具有強(qiáng)烈的抑制活性，是目前人類使用抗生素的最后一道防線，在使用過程中具有腎毒性和神經(jīng)毒性。多粘菌素B是由多黏類芽孢桿菌通過非核糖體肽合成酶催化生產(chǎn)的含有多種同系物的復(fù)雜混合物，臨床以及商業(yè)多粘菌素B制劑中通常包括B1、B2、B3、B1-1四種同系物，其中主要成分是B1與B2。不同的單一組分活性不同，且聯(lián)合使用效果不同，引起的臨床效應(yīng)也不同。許多文獻(xiàn)報(bào)道了非核糖體肽合成酶的機(jī)理，通過培養(yǎng)基優(yōu)化調(diào)控其他脂肽物質(zhì)的組分，同時(shí)也有研究多粘菌素的基因簇以及合成機(jī)制，但是多粘菌素B的組分調(diào)控的機(jī)制仍不是很清楚，并且不同的菌株生產(chǎn)多粘菌素的組分比例也不盡相同，因此缺少調(diào)控多粘菌素B同系物組分的有效方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種調(diào)控多粘菌素B同系物組分的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
一種調(diào)控多粘菌素B同系物組分的方法，包括如下步驟：
(1)質(zhì)粒構(gòu)建：將對亮氨酸特異性的腺苷酸活化結(jié)構(gòu)域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上A7結(jié)構(gòu)域的上游500bp同源臂基因與CJX518多粘菌素合成基因簇上A7結(jié)構(gòu)域的下游500bp同源臂基因，通過重疊延伸PCR的方法相連得到的片段連接到載體pGEMT-Easy，獲得載體pT-A，通過BamH I與Sal I雙酶切pT-A與pMAD質(zhì)粒，將酶切片段相連，得到pMAD-△A；
將對6-甲基辛酸、6-甲基庚酸強(qiáng)特異性識別的縮合結(jié)構(gòu)域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上C1結(jié)構(gòu)域的上游500bp同源臂基因與CJX518多粘菌素合成基因簇上C1結(jié)構(gòu)域的下游500bp同源臂基因通過重疊延伸PCR的方法相連得到的片段連接到載體pGEMT-Easy獲得載體pT-C，通過BamH I與Sal I雙酶切pT-C與pMAD質(zhì)粒，將酶切片段相連，得到pMAD-△C；
所述對亮氨酸特異性的腺苷酸活化結(jié)構(gòu)域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7結(jié)構(gòu)域的上游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7結(jié)構(gòu)域的下游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述對6-甲基辛酸、6-甲基庚酸強(qiáng)特異性識別的縮合結(jié)構(gòu)域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1結(jié)構(gòu)域的上游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1結(jié)構(gòu)域的下游500bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(2)菌種構(gòu)建：將pMAD-△A轉(zhuǎn)化CJX518，通過抗生素和藍(lán)白斑篩選得到轉(zhuǎn)化成功的菌株，再42-45℃培養(yǎng)傳代得到質(zhì)粒丟失菌株，通過PCR測序驗(yàn)證為結(jié)構(gòu)域替換菌株518-A；
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