[發明專利]一種調控多粘菌素B同系物組分的方法

有效

• 申請號: 201911341235.6
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN111041037B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 程景勝;袁野;元英進
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12P21/04;C07K7/62;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 曹玉平

1.一種調控多粘菌素B同系物組分的方法，其特征包括如下步驟：

（1）質粒構建：將對亮氨酸特異性的腺苷酸活化結構域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上A7結構域的上游500 bp同源臂基因與CJX518多粘菌素合成基因簇上A7結構域的下游500 bp同源臂基因，通過重疊延伸PCR的方法相連得到的片段，通過BamH I與Sal I雙酶切連接到載體pGEMT-Easy，獲得載體pT-A，通過BamH I與Sal I雙酶切pT-A與pMAD質粒，將酶切片段相連，得到pMAD-△A；

將對6-甲基辛酸、6-甲基庚酸強特異性識別的縮合結構域基因、CJX518多粘菌素合成基因簇上C1結構域的上游500 bp同源臂基因與CJX518多粘菌素合成基因簇上C1結構域的下游500 bp同源臂基因通過重疊延伸PCR的方法相連得到的片段，通過BamH I與Sal I雙酶切連接到載體pGEMT-Easy獲得載體pT-C，通過BamH I與Sal I雙酶切pT-C與pMAD質粒，將酶切片段相連， 得到pMAD-△C；

所述對亮氨酸特異性的腺苷酸活化結構域基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7結構域的上游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；

所述CJX518多粘菌素合成基因簇上A7結構域的下游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；

所述對6-甲基辛酸、6-甲基庚酸強特異性識別的縮合結構域基因的核苷酸序列如SEQID NO.4 所示；

所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1結構域的上游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示；

所述CJX518多粘菌素合成基因簇上C1結構域的下游500 bp同源臂基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示；

（2）菌種構建：將pMAD-△A轉化CJX518，通過抗生素和藍白斑篩選得到轉化成功的菌株，再42-45℃ 培養傳代得到質粒丟失菌株，通過PCR 測序驗證為結構域替換菌株518-A；

再將pMAD-△C轉化所述結構域替換菌株518-A，通過抗生素和藍白斑篩選得到轉化成功的菌株，再42-45℃ 培養傳代得到質粒丟失菌株，通過PCR 測序驗證為結構域替換菌株518-AC；

（3）種子培養：將結構域替換菌株518-AC在種子培養基中培養，得到一級種子；將一級種子在種子培養基中培養，得到二級種子；

（4）多粘菌素B生產：將步驟（3）獲得的二級種子按初始OD₆₀₀為0.2的接種量接入發酵培養基中，在轉速為180-250 rpm，溫度為28-37℃條件下搖瓶發酵72小時。