[發明專利]一種利用羥基酸脫氫酶制備L-草銨膦的方法

有效

• 申請號: 201911337722.5
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN111019982B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 楊立榮;周海勝;許金玲;吳堅平;張紅玉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種利用羥基酸脫氫酶制備L?草銨膦的方法，以2?羥基?4?(羥基甲基膦?；?丁酸為原料，經羥基酸脫氫酶和氨基酸脫氫酶兩步催化制備L?草銨膦。本發明具有以下有益效果：(1)本發明方法以2?羥基?4?(羥基甲基膦?；?丁酸為底物，經由羥基酸脫氫酶和氨基酸脫氫酶組成的酶催化體系催化獲得產物L?草銨膦，實現了輔酶的自循環、無需要額外的輔酶再生系統以及輔酶再生原料。(2)本發明方法構建了一種全新的生物(酶)催化體系用于生產L?草銨膦；這種生物催化體系制備L?草銨膦的工藝路線目前尚未見報導。(3)本發明方法的最終產品中沒有任何副產物的生成，從而極大地簡化了L?草銨膦的后續精制工藝，提高了產品總收率。

技術領域

本發明涉及酶工程技術領域，特別是涉及一種利用羥基酸脫氫酶制備L-草銨膦的方法。

背景技術

草銨膦(Phosphinothricin，又名Glufosinate)是一種含磷氨基酸類除草劑，化學名為2-氨基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠-丁酸。草銨膦是全球第三大滅生性除草劑及第二大轉基因作物除草劑，其具有殺草譜廣、低毒、活性高和環境相容性好等特點，被廣泛應用于非耕地、免耕地、農田作物、水生田等雜草的防除。

草銨膦存在兩種光學構型，但只有L-型具有除草活性(Herbicidal compositions[P].Patent application US4265654A，1981)，而且在土壤中易于降解，對環境的危害較小。目前市場上銷售的草銨膦一般都是外消旋混合物，如果草銨膦產品能以L-構型的純光學異構體形式使用，可使草銨膦的使用量降低50％，這將極大地提高原子經濟性、降低生產和使用成本、減輕環境壓力。因此，開發一種低成本、可工業化的L-草銨膦生產方法，具有極其重要的經濟價值和社會價值。

制備光學純L-草銨膦的方法主要有三種：化學不對稱合成法、手性拆分法以及生物催化法?；瘜W不對稱合成法從手性原料出發合成光學純L-草銨膦，多見于實驗室研究中，其工藝步驟多、收率低，所用不對稱合成試劑和催化劑大多比較昂貴，導致生產成本偏高，不利于大規模制備L-草銨膦。手性拆分法則存在以下固有缺點，一是需要使用手性拆分試劑，二是D-草銨膦需要重新消旋再利用，三是單次拆分收率低，四是工藝比較復雜。

相比之下，生物催化法具有立體選擇性嚴格、反應條件溫和、收率高以及產物易分離純化等優點，是生產L-草銨膦的潛在優勢方法。這類反應中的代表就是酶催化的轉氨基作用和酶催化的還原胺化，涉及到的酶分別為轉氨酶和氨基酸脫氫酶。

Hoechst公司的研究人員對轉氨酶工藝做了一系列研究，產品L-草銨膦濃度最高可達420mM，ee值達到99.9％(Schultz A,Taggeselle P,Tripier D,et al.Applied andEnvironmental Microbiology.Jan 1990,56(1):1-6)。中國專利CN1349561篩選得到了能夠特異性地催化2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸(PPO)的草酰乙酸轉氨酶，可直接利用L-天冬氨酸為氨基供體進行轉氨基反應，當底物PPO的濃度為552mmol/L、在消耗大約700mmol/L的L-天冬氨酸的情況下，只生成251.9mmol/L的產物L-草銨膦，與此同時生成了大約234.5mmol/L的雜質丙氨酸，原料PPO的轉化率只有52％。此外，中國專利CN105603015公開了一種利用L-丙氨酸為氨基供體、采用特定轉氨酶制備L-草銨膦的方法，原料轉化率達100％，丙氨酸與底物PPO的摩爾比為1:1～6:1。總的來說，轉氨酶雖然具有催化活力高、立體選擇性良好等優點，但也存在兩大致命缺陷，其一是轉氨酶催化的反應為可逆反應，原料PPO不能完全轉化為L-草銨膦，只有在過量氨基供體存在的條件下才能達到完全轉化；其二是過量的氨基供體殘余、以及氨基供體反應后生成的酮酸副產物都給產品的分離精制帶來了很大的麻煩。