[發明專利]一種原代細胞培養的方法

有效

• 申請號: 201911337507.5
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN110923194B
• 公開（公告）日: 2021-08-13
• 發明（設計）人: 黃誠坤;鐘國亮;勞海金
• 申請（專利權）人: 廣東依浦賽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 溫旭;肖宇揚

1.一種培養原代細胞的方法，其特征在于：

所述原代細胞為肺癌細胞；所述方法所采用的試劑種類包括培養液A、胎牛血清、GlutaMAX^TM補充液、青霉素-鏈霉素-新霉素溶液、EGF、bFGF、膠原酶IV、DNA酶I、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液；

所述培養液A中添加有無機鹽、氨基酸、維生素和其他添加物；

所述無機鹽及其對應的在所述培養液A中的濃度如下：氯化鈣0.1g/L～0.15g/L，硫酸銅0.5μg/L～1μg/L，硝酸鐵10μg/L～80μg/L，硫酸亞鐵0.2mg/L～0.5mg/L，硫酸鎂0.05g/L～1g/L，氯化鉀0.2g/L～0.5g/L，碳酸氫鈉1g/L～1.5g/L，氯化鈉5g/L～10g/L，磷酸一鈉0.05g/L～0.1g/L，磷酸二鈉0.05g/L～0.1g/L，硫酸鋅0.3mg/L～0.7mg/L；

所述氨基酸及其對應的在所述培養液A中的濃度如下：L-丙氨酸3mg/L～4mg/L，L-精氨酸鹽酸鹽0.1g/L～0.2g/L，L-天門冬酰胺一水物5mg/L～10mg/L，L-天冬氨酸5mg/L～8mg/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物0.01g/L～0.02g/L，L-胱氨酸二鹽酸鹽0.02g/L～0.05g/L，L-谷氨酸5mg/L～10mg/L，L-谷氨酰胺0.2g/L～0.5g/L，甘氨酸0.01g/L～0.03g/L，L-組氨酸鹽酸鹽一水物0.02g/L～0.05g/L，L-異亮氨酸0.03g/L～0.07g/L，L-亮氨酸0.03g/L～0.07g/L，L-賴氨酸鹽酸鹽0.07g/L～0.12g/L，L-蛋氨酸15mg/L～20mg/L，L-苯丙氨酸0.02g/L～0.05g/L，L-脯氨酸0.01g/L～0.03g/L，L-絲氨酸0.02g/L～0.05g/L，L-蘇氨酸0.04g/L～0.06g/L，L-色氨酸8mg/L～10mg/L，L-酪氨酸二鈉鹽二水物0.04g/L～0.06g/L，L-纈氨酸0.04g/L～0.06g/L；

所述維生素及其對應的在所述培養液A中的濃度如下：維生素H 2μg/L～5μg/L，氯化膽堿7mg/L～10mg/L，葉酸1.5mg/L～3mg/L，肌醇0.1g/L～0.2g/L，煙酰胺1mg/L～4mg/L，維生素B₅ 1mg/L～4mg/L，維生素B₆ 1mg/L～4mg/L，維生素B₂ 0.1mg/L～0.3mg/L，維生素B₁1mg/L～3mg/L，維生素B₁₂ 0.5mg/L～1mg/L；

所述其他添加物包括DL-硫辛酸、羥乙基哌秦乙硫磺酸、腐胺、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷，在所述培養液A中，DL-硫辛酸的濃度為0.05mg/L～0.15mg/L，羥乙基哌秦乙硫磺酸的濃度為3g/L～5g/L，腐胺的濃度為50μg/L～100μg/L，次黃嘌呤的濃度為2mg/L～4mg/L，胸腺嘧啶核苷的濃度為0.2mg/L～0.5mg/L；

所述方法包括以下步驟：

S1.配制培養液B和解離液：

所述培養液B包括以下組分:所述培養液A+5％～20％所述胎牛血清+1×所述GlutaMAX^TM補充液+1×所述青霉素-鏈霉素-新霉素溶液+70ng/mL～ 120ng/mL所述EGF+70ng/mL～120ng/mL所述bFGF，

所述解離液包括以下組分：所述培養液A、所述胎牛血清、所述膠原酶IV、所述DNA酶I、所述青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液，其中，所述培養液A、所述胎牛血清、所述DNA酶I、所述青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液的用量體積比為：所述培養液A：所述胎牛血清：所述DNA酶I：所述青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液＝35～4：6～15：2～3：0.1～1，所述膠原酶IV在所述解離液中的濃度為0.4g/L～0.5g/L；

S2.在所述培養液A中剪碎組織樣本；

S3.將經過所述S2處理后的組織樣本置于所述解離液中消化，消化完畢后收集細胞；

S4.將所述S3得到的細胞置于所述培養液B中進行培養。

2.如權利要求1所述培養原代細胞的方法，其特征在于：

所述S1還包括以下步驟：

配制保存液，所述保存液包括以下組分：所述培養液A+5％～20％所述胎牛血清+1×所述青霉素-鏈霉素-新霉素溶液，

配制清洗液，所述清洗液包括以下組分：生理鹽水+0.5％～1.2％青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液；

所述S2的具體操作為：

將取得的所述組織樣本保存于所述保存液中帶至細胞培養場所，將所述組織樣本置于所述培養液A中，并在所述培養液A中剔除所述組織樣本表面的血塊、脂肪，利用所述清洗液清洗所述組織樣本，將所述組織樣本再次置于所述培養液A中，并在所述培養液A中剪碎所述組織樣本。