[發(fā)明專利]一種培養(yǎng)基及其用于檢測(cè)大腸桿菌的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911336943.0
• 申請(qǐng)日: 2019-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN110819689B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉玲;董銘;董紹俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/10
• 分類號(hào): C12Q1/10;C12Q1/06;C12Q1/04;C12R1/19
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 22214
• 代理人: 周蕾

本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基及其用于檢測(cè)大腸桿菌的應(yīng)用，屬于大腸桿菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的培養(yǎng)基包括酶底物1為4?甲基傘形酮?β?D?葡萄糖醛酸苷、營養(yǎng)物2為胰蛋白胨或蛋白胨和貯存液3；所述貯存液3的組成成分為：磷酸鹽緩沖溶液：每升含量包括磷酸二氫鉀10g、磷酸氫二鉀25g、磷酸氫二鈉20g和氯化銨2g；硫酸鎂溶液11g/L；氯化鈣溶液28g/L；氯化鐵溶液0.15g/L。本發(fā)明的培養(yǎng)基的貯存液3有利于加速大腸桿菌產(chǎn)生酶分解底物，突出的是針對(duì)低濃度大腸桿菌檢測(cè)能縮短檢測(cè)時(shí)間。貯存液3為獨(dú)立的鹽溶液，在0?4℃穩(wěn)定保存6個(gè)月以上，方便實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)。本發(fā)明培養(yǎng)基用于檢測(cè)大腸桿菌的方法，檢測(cè)結(jié)果為大腸桿菌的具體濃度值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及大腸桿菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)基及其用于檢測(cè)大腸桿菌的應(yīng)用。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)的大腸桿菌(E.coli)檢測(cè)方法主要包括多管發(fā)酵、濾膜法和平板計(jì)數(shù)法(GB4789.3-2016替代GB/T4789.32-2002)，這些方法都具有操作繁瑣、耗時(shí)長和靈敏度低的缺點(diǎn)。近年來，科學(xué)工作者發(fā)展了很多快速檢測(cè)方法，主要分為三類：分子生物學(xué)方法、免疫分析技術(shù)和代謝學(xué)技術(shù)。其中，分子生物學(xué)方法是基于遺傳物質(zhì)的檢測(cè)，準(zhǔn)確性有保障。但是該方法需要專業(yè)儀器和技術(shù)，不能實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)；且檢測(cè)信號(hào)基于遺傳物質(zhì)擴(kuò)增(PCR等)，檢測(cè)限一般在10²以上。免疫分析技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測(cè)，但是該技術(shù)只針對(duì)表面抗原、抗體已知菌的檢測(cè)，如大腸桿菌O157：H7試劑盒，是針對(duì)某一血清型大腸桿菌的檢測(cè)，不能完成水體中所有大腸桿菌的廣譜檢測(cè)。基于代謝學(xué)檢測(cè)的技術(shù)能夠檢測(cè)水中大部分類型的大腸桿菌。目前最有效的是利用E.coli產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶的特點(diǎn)，能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)生成具有熒光的4-甲基傘形酮(4-MU)進(jìn)行檢測(cè)，94-97％的大腸桿菌具有該代謝途徑。

現(xiàn)有技術(shù)1已被列入國標(biāo)法(HJ1001-2018)，該方法使用Minimal Medium ONPG-MUG(MMO-MUG)培養(yǎng)基，采用97孔板，計(jì)數(shù)反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)具有熒光的格子(存在大腸桿菌將MUG轉(zhuǎn)化為4-MU的格子)，然后根據(jù)有熒光格子的數(shù)量查表得出樣品中大腸桿菌的最大可能數(shù)(MPN)。該方法存在不足為：1、反應(yīng)時(shí)間要大于24h，才能使培養(yǎng)基中MUG絕大部分轉(zhuǎn)化為4-MU，積累到肉眼可見的量；2、每個(gè)格子里面含有大腸桿菌的數(shù)量差異無法體現(xiàn)，都被記作一個(gè)“有熒光的格子”后查表，所以不能得到樣品中大腸桿菌的具體濃度值；即該方法給出的結(jié)果為最大可能數(shù)MPN，不是具體濃度值；3、檢出限為10MPN/L，并且因不區(qū)分單個(gè)格子中大腸桿菌數(shù)量，不具備線性。4、配置為溶液后需要立即使用，對(duì)于在線監(jiān)測(cè)儀器的運(yùn)維難以實(shí)現(xiàn)。現(xiàn)有技術(shù)2申請(qǐng)?zhí)枮?00410051350.7的中國專利申請(qǐng)公開了一種快速測(cè)定大腸桿菌的檢測(cè)方法，該方法將配制好的MUG培養(yǎng)液，分裝于試管，接種樣品到培養(yǎng)液中，35-44℃下培養(yǎng)6-12h后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定366nm處培養(yǎng)液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)該條件下熒光強(qiáng)度與菌濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，測(cè)得樣品中大腸桿菌數(shù)。該方法存在不足為：1、低于10個(gè)大腸桿菌樣品檢測(cè)時(shí)間大約需20-24h；2、配置為溶液后需要立即使用，在實(shí)驗(yàn)室操作可以實(shí)現(xiàn)，但是對(duì)于在線監(jiān)測(cè)儀器的運(yùn)維難以實(shí)現(xiàn)。基于代謝學(xué)檢測(cè)大腸桿菌的培養(yǎng)基組成可歸納為三種成分：酶底物，如MUG等；營養(yǎng)物，如蛋白胨、牛肉膏和酵母浸膏等；鹽溶液，目前本領(lǐng)域多沿用MMO-MUG的鹽溶液。在這三種成分中，酶底物的作用是指示劑；營養(yǎng)物提供大腸桿菌分裂增生的底物；鹽溶液是影響大腸桿菌活性和代謝活性的有效因素。因此，對(duì)鹽溶液的研究可以加快反應(yīng)，提升檢測(cè)速度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)問題，提供一種培養(yǎng)基及其用于檢測(cè)大腸桿菌的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

本發(fā)明提供一種培養(yǎng)基，包括：酶底物1、營養(yǎng)物2、和貯存液3；

所述酶底物1為4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，縮寫MUG)；