[發(fā)明專利]構(gòu)建側(cè)翼已知序列的測(cè)序文庫的引物組和方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911336316.7
• 申請(qǐng)日: 2019-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN113088561A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶自豪;楊林;張艷艷;陳芳;蔣慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

本發(fā)明提出了引物組，所述引物組包括：第一組引物和第二組引物，所述第一組引物包括第一引物和第二引物，沿5’端到3’端方向，所述第一引物包括第一特異性序列、第一間隔固定序列以及第一隨機(jī)序列，所述第二引物包括第二特異性序列、第二間隔固定序列以及第二隨機(jī)序列；所述第二組引物包括第三引物和第四引物，所述第三引物的3’端為所述第一間隔固定序列，所述第四引物的3’端為所述第二間隔固定序列。利用本發(fā)明的引物組可以獲得具有不同長(zhǎng)度的測(cè)序文庫，尤其適用于側(cè)翼已知序列，獲得的文庫可直接用于二代測(cè)序，操作簡(jiǎn)便快速，成本低廉，適于規(guī)模化應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及構(gòu)建側(cè)翼已知序列的測(cè)序文庫的引物和方法。

背景技術(shù)

已知側(cè)翼序列獲取未知序列的方法通常采用PCR擴(kuò)增，通過側(cè)翼序列擴(kuò)增未知序列然后進(jìn)行測(cè)序。如采用16S進(jìn)行物種鑒定或進(jìn)行菌種鑒定，都是在基因兩端的保守區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，擴(kuò)增中間的未知可變區(qū)域，然后擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，從而對(duì)物種進(jìn)行鑒別。但是，該方法受限于未知可變的長(zhǎng)度，當(dāng)長(zhǎng)度大于1kb時(shí)，不能對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行有效的測(cè)序。對(duì)于這種情況，現(xiàn)在常用的方法是通過長(zhǎng)片段擴(kuò)增后進(jìn)行鳥槍法打斷進(jìn)行高通量測(cè)序，構(gòu)建二代測(cè)序文庫的策略通常是將擴(kuò)增的長(zhǎng)片段打斷、Tn5轉(zhuǎn)座或者通過多重PCR獲得長(zhǎng)度合適的小片段。

將長(zhǎng)片段打斷后建庫是常用的建庫方法，實(shí)驗(yàn)流程包括目的片段的擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、純化產(chǎn)物的片段化、末端修復(fù)、3端加A和連接接頭，整個(gè)建庫流程比較繁瑣且成本相對(duì)比較高。Tn5轉(zhuǎn)座法，如Illumina公司的Nextera技術(shù)，是通過包埋有通用序列的Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合物將擴(kuò)增產(chǎn)物片段化并加上通用序列，在通過通用引物擴(kuò)增加上測(cè)序接頭，該方法成本也相對(duì)比較高。

因此，目前針對(duì)側(cè)翼已知序列構(gòu)建測(cè)序文庫的方法仍有待研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題至少之一。

為此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種引物組。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述引物組包括：第一組引物和第二組引物，所述第一組引物包括第一引物和第二引物，沿5’端到3’端方向，所述第一引物包括第一特異性序列、第一間隔固定序列以及第一隨機(jī)序列，所述第二引物包括第二特異性序列、第二間隔固定序列以及第二隨機(jī)序列，所述第一特異性序列與雙鏈DNA中第1鏈上5’端已知序列匹配，所述第二特異性序列與所述雙鏈DNA中第2鏈上5’端已知序列匹配，所述第一間隔固定序列與所述雙鏈DNA中第1鏈不匹配，所述第二間隔固定序列與所述雙鏈DNA中第2鏈不匹配；所述第二組引物包括第三引物和第四引物，所述第三引物的3’端為所述第一間隔固定序列，所述第四引物的3’端為所述第二間隔固定序列。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的引物組包括兩組引物組，第一組引物組中的兩種引物均包含三段序列，包括特異性序列、間隔固定序列和隨機(jī)序列。具體地，第一特異性序列和第二特異性序列能夠分別錨定到側(cè)翼已知序列5’端的已知序列上，基于DNA鏈在三維空間上的可折疊性，第一隨機(jī)序列與第二隨機(jī)序列分別與側(cè)翼已知序列種的未知序列的任意位置堿基互補(bǔ)配對(duì)并延伸，得到不均等片段大小的產(chǎn)物。然后，采用第二組引物，其中包含兩種引物，每種引物的3’端為間隔固定序列，由此，可以通過擴(kuò)增產(chǎn)物中的間隔固定序列的反向鏈進(jìn)行錨定互補(bǔ)，從而得到高通量測(cè)序文庫。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的引物組可以獲得具有不同長(zhǎng)度的測(cè)序文庫，尤其適用于側(cè)翼已知序列，獲得的文庫可直接用于二代測(cè)序，操作簡(jiǎn)便快速，成本低廉，適于規(guī)模化應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述引物組還可以具有下列附加技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一間隔固定序列和第二間隔固定序列為接頭序列。該接頭序列為測(cè)序平臺(tái)所固有的接頭序列，由此，以便在擴(kuò)增過程中連接上測(cè)序接頭，便于實(shí)現(xiàn)后續(xù)測(cè)序。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第三引物和第四引物的5’端包括文庫標(biāo)簽序列和文庫標(biāo)簽測(cè)序引物結(jié)合序列。由此，以便于后續(xù)識(shí)別和測(cè)序。