[發明專利]一種具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢桿菌及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201911326529.1
• 申請日: 2019-12-20
• 公開（公告）號: CN111172060A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 寸海春;何月秋;趙崇鈞;許濤;趙枝超;彭嘉誠;毛明林;李誠;張麗芳
• 申請（專利權）人: 云南省微生物發酵工程研究中心有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/22;A01P3/00;C12R1/125
• 代理公司: 昆明鴻昊知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 53211
• 代理人: 方正巧

1.一種具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢桿菌，其特征在于：所述的芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YX-11，所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YX-11的保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日為：2019年09月02日，保藏編號為：CGMCC No.18456。

2.一種權利要求1所述的具有防治香蕉枯萎病功能的芽孢桿菌YX-11的制備方法，其特征在于：包括以下步驟

1)培養材料準備：

選擇采摘健康、無病害香蕉植株的香蕉葉片備用；

將LB固體培養基和PDA培養基融化，分別倒入滅菌培養皿，冷卻，制成LB培養基平板和PDA培養基平板；其中，LB培養基平板用于分離和保存內生細菌，PDA培養基平板用于培養香蕉枯萎病菌和對峙培養；

2)分離培養：

取香蕉葉片經酒精消毒后，用滅菌水沖洗3～5次，置于滅菌的研缽中研磨成汁，將研磨得到的汁液涂布于LB培養基平板上；隨機挑取形態不同的菌落進行純化培養并保存，將純化培養所得的其中一株菌株命名為YX-11；

3)拮抗內生細菌篩選：

以香蕉枯萎病菌為指示菌，將挑選出的菌株YX-11采用PDA平板對峙培養法培養，在培養過程中觀察菌株YX-11對香蕉枯萎病菌的抑菌作用，并測定其抑菌帶寬度大小；

4)拮抗內生細菌YX-11的鑒定。

3.一種權利要求1所述的枯草芽孢桿菌YX-11的菌劑，其特征在于：是以所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YX-11經種子液一級制備、種子液二級制備和發酵得到。

4.一種權利要求3所述的枯草芽孢桿菌YX-11菌劑的制備方法，包括A一級種子液制備，B二級種子液制備，C發酵液制備，其特征在于：具體步驟為

A一級種子液制備，選取經過活化的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YX-11以5～10％的接種量接種到種子培養基上，培養10～15h得到菌種的得到一級種子液；

B二級種子液制備，按1～3％的接種量，將一級種子液轉接到種子罐內的二級種子培養基上，培養10～15h得到二級種子液；

C發酵液制備，按1～3％的接種量，將二級種子液接種到發酵罐內的發酵培養基上，培養46～48h得到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YX-11的發酵液，即為具有防治香蕉枯萎病功能的枯草芽孢桿菌菌劑。

5.根據權利要求4所述的枯草芽孢桿菌YX-11菌劑的制備方法，其特征在于：所述的步驟A中，菌種在培養溫度35～37℃、轉速155～165rpm/min條件下，搖床培養10～15h，所述種子培養基為常規的液體LB培養基，pH值為7.0～8.0。

6.根據權利要求4所述的枯草芽孢桿菌YX-11菌劑的制備方法，其特征在于：所述的步驟B中，一級種子液在35～38℃，轉速100rpm/min，通氣量為1.5×10⁶mL/h，罐壓保持在0.04～0.06MPa條件下培養10～15h。

7.根據權利要求4所述的枯草芽孢桿菌YX-11菌劑的制備方法，其特征在于：所述的步驟C中，二級種子液在35～38℃，轉速100rpm/min，通氣量為1.5×10⁶mL/h、罐壓保持在0.04～0.06MPa條件下培養46～48h。

8.根據權利要求4所述的枯草芽孢桿菌YX-11菌劑的制備方法，其特征在于：所述的步驟B中的二級種子培養基、步驟C的中發酵培養基均由以質量分數計的以下成分組成：黃豆粉1.4％，蔗糖3％，蛋白胨3％，玉米粉3％，魚粉2％，氯化鈉0.03％，硫酸鎂0.05％，碳酸鈣6％，磷酸二氫鉀0.03％，磷酸氫二鉀0.03％，硫酸錳0.02％，余量為水，pH值為7.0～8.0。