[發明專利]運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法

有效

• 申請號: 201911326078.1
• 申請日: 2019-12-20
• 公開（公告）號: CN110846410B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 丁功濤;魏嘉;蘭海鷗;馬忠仁
• 申請（專利權）人: 西北民族大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851
• 代理公司: 南昌大牛知識產權代理事務所(普通合伙) 36135
• 代理人: 喻莎

本發明提供了一種運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法。該技術方案針對核桃過敏原基因jug?r?1設計特異性引物和探針，并確定反應條件，從而建立了熒光定量PCR檢測核桃過敏原的方法。具體來看，本發明首先在NBCI數據庫中，根據核桃過敏原基因jug?r?1設計特異性引物和探針；在此基礎上，以從檢測樣本中提取的DNA作為模板，以特異性引物及探針對目的基因進行擴增；擴增過程使用實時熒光定量PCR儀器對熒光強度進行測量，若出現擴增曲線則說明樣本中含有核桃過敏原成分，反之則不含有核桃過敏原成分。本發明方法具有良好的特異性和重復性，檢測的靈敏度可達到1.18×10supgt;?/supgt;supgt;11/supgt;ng/μl。

技術領域

本發明涉及分子生物學和核酸檢測技術領域，進一步涉及基于基因檢測技術的食物過敏原檢測方法，具體涉及一種運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法。

背景技術

食物過敏也稱為食物變態反應或消化系統變態反應、過敏性胃腸炎等，是由于某種食物或食品添加劑等引起的IgE介導和非IgE介導的免疫反應，而導致消化系統內或全身性的變態反應。食物過敏已成為全球共同關注的焦點問題，它能引起急性或慢性疾病，危害人類健康。研究顯示，成人的食物過敏率約為5％，而兒童的食物過敏率接近于8％，并且數據表明，發病人數和死亡人數均呈上升趨勢。在所有的過敏反應中，花生和堅果引起的過敏反應能達到47％。

2006年1月1日后，由FAD發布的《食物過敏原標識和消費者保護法案》正視生效，法案中規定的乳、蛋、魚、甲殼類水生動物、樹堅果、小麥、花生、大豆等八種主要食物過敏原在其食物包裝袋上必須進行標注。

核桃屬于樹堅果的一種，是常見的過敏原成分。目前國內外對于核桃過敏原成分的檢測主要集中在ELISA及PCR等方面。目前對于核桃過敏原檢測方法，FAD推薦的試劑盒只有一種ELISA試劑盒。但如果產品在加工過程中，蛋白遭到破壞，ELISA試劑盒可能無法檢測。相對于蛋白而言，DNA性質比較穩定，以其作為檢測目標更加可靠；然而，選擇何種基因作為檢測目標，采用怎樣的檢測方法才能保證檢測的特異性和靈敏性，現有技術尚未獲得理想的解決方案。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，以解決現有技術中缺乏此類方法的技術問題。

本發明要解決的另一技術問題是，如何在基于基因檢測的核桃過敏原成分檢測方法中，充分保證特異性和靈敏。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，該方法以核桃jug?r?1基因作為檢測目標。

作為優選，該方法中所采用的探針，其5’端由Cy5基團標記，3’端由BHQ2基團標記。

作為優選，該方法先提取檢材的DNA，以其為模板，以序列為5’-AGTGCATATTTCATACCTTTC-3’和5’-CGATCTCCATGGTTGTTA-3’的核苷酸片段為上、下游引物，以序列為5’-CAATGACCAGGCTCGCAACTC-3’的核苷酸片段為探針，執行實時熒光定量PCR反應。

作為優選，所述實時熒光定量PCR反應的反應體系如下：熒光定量混合液10μL，濃度為17.5μM的上游引物1μL，濃度為17.5μM的下游引物1μL，濃度為9.5μM的探針0.5μL，DNA模板1μL，H₂O?6.5μL，總量20μL；所述實時熒光定量PCR反應的反應程序如下：95℃5min；95℃1min，47.6℃30sec，39個循環。