[發明專利]運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法

有效

• 申請號: 201911326078.1
• 申請日: 2019-12-20
• 公開（公告）號: CN110846410B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 丁功濤;魏嘉;蘭海鷗;馬忠仁
• 申請（專利權）人: 西北民族大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851
• 代理公司: 南昌大牛知識產權代理事務所(普通合伙) 36135
• 代理人: 喻莎

1.運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，其特征在于，該方法以核桃jug?r?1基因作為檢測目標；所采用的探針，其5’端由Cy5基團標記，3’端由BHQ2基團標記；該方法先提取檢材的DNA，以其為模板，以序列為5’-AGTGCATATTTCATACCTTTC-3’和5’-CGATCTCCATGGTTGTTA-3’的核苷酸片段為上、下游引物，以序列為5’-CAATGACCAGGCTCGCAACTC-3’的核苷酸片段為探針，執行實時熒光定量PCR反應。

2.根據權利要求1所述的運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR反應的反應體系如下：熒光定量混合液10?μL，濃度為17.5?μM的上游引物1?μL，濃度為17.5?μM的下游引物1?μL，濃度為9.5?μM的探針0.5?μL，DNA模板1μL，H₂O?6.5?μL，總量20?μL；

所述實時熒光定量PCR反應的反應程序如下：95?℃5?min；95?℃1?min，47.6?℃30sec，39個循環。

3.根據權利要求1所述的運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，其特征在于，在執行該方法前，先以核桃標準質粒為模板，以序列為5’-AGTGCATATTTCATACCTTTC-3’和5’-CGATCTCCATGGTTGTTA-3’的核苷酸片段為上、下游引物，以序列為5’-CAATGACCAGGCTCGCAACTC-3’的核苷酸片段為探針，執行實時熒光定量PCR反應；繪制標準曲線。

4.根據權利要求3所述的運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，其特征在于，所述核桃標準質粒是通過以下方法構建的：取核桃植株的新鮮葉片，提取總DNA，以其為模板PCR擴增核桃jug?r?1基因，擴增產物經分離純化后與pUC18載體連接，而后將連接產物轉入感受態的大腸桿菌E.coli?DH5α中，從菌液中提取質粒，經鑒定得到所述核桃標準質粒。

5.根據權利要求4所述的運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，其特征在于，所述以其為模板PCR擴增核桃jug?r?1基因，此過程所采用的上下游引物分別是序列為5’-TTCAACGTGACCATCTCCCC-3’的核苷酸片段和序列為5’-ACACGAGGATGTGCTTGCTA-3’的核苷酸片段。

6.根據權利要求5所述的運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，其特征在于，所述以其為模板PCR擴增核桃jug?r?1基因，此過程的PCR反應體系為：GXL酶?2?μL，5Buffer20?μL，dNTP4?μL，上游引物2?μL，下游引物2?μL，模板DNA?4?μL，ddH₂O?66?μL，總量100?μL。

7.根據權利要求6所述的運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，其特征在于，所述以其為模板PCR擴增核桃jug?r?1基因，此過程的PCR反應程序為：98?℃5?min；98℃?30?s，54?℃30?s，68?℃1?min，34個循環；68?℃10?min。

8.根據權利要求3所述的運用實時熒光定量PCR檢測食品中核桃過敏原的方法，其特征在于，用于繪制標準曲線的若干樣本，其核桃標準質粒的濃度范圍為1.55×10³~1.55×10⁹copies/μL。