[發(fā)明專利]一種重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911325340.0
• 申請(qǐng)日: 2019-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN113004388A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱禎平;黃浩旻;肖建國(guó)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 三生國(guó)健藥業(yè)（上海）股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/48
• 分類號(hào): C07K14/48;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/16;C12P21/02;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
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本發(fā)明提供了一種重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，雜質(zhì)少，純度高，生物活性好，可以作為治療藥物，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程范疇，涉及用基因工程方法制備高純度、高活性、無修飾的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子。

背景技術(shù)

Oxervate(cenegermin，重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子，rhNGF)是意大利制藥商Dompé原研的一款滴眼液，是一種用于中度至重度神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜炎(neurotrophic keratitis，NK)成人患者的治療的孤兒藥，目前已在歐盟和美國(guó)上市。另外，其用于治療阿爾茲海默癥的適應(yīng)癥也在研發(fā)中。

為了制備重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子，原研廠商首先表達(dá)proNGF包涵體，然后再變復(fù)性，純化proNGF復(fù)性液，酶切純化得到重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子。然而，該方法需要酶切，酶切后還需要純化，步驟較多，過程較為繁瑣。

因此，研究人員一直希望找到一種簡(jiǎn)單的、能夠直接變復(fù)性的方法。Collins,etal.(US5,986,070)發(fā)明了一種rhNGF直接變復(fù)性的方法，其采用Tris作為緩沖液，在8M尿素條件下變性，在8M尿素條件下復(fù)性，這種方法獲得了高活性的rhNGF。但是，這種方法獲得的rhNGF經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定，有許多分子量與rhNGF接近的雜質(zhì)，這些雜質(zhì)可能是rhNGF的修飾產(chǎn)物。由于修飾后的rhNGF和未修飾的rhNGF的分子量和性質(zhì)都非常接近，這給后續(xù)分離純化造成了困難，常規(guī)方法很難分開，即使分開，收率也較低。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種高純度、高活性、無修飾的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法。本申請(qǐng)的發(fā)明人在對(duì)rhNGF的長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用碳酸氫銨(NH₄HCO₃)作為緩沖液，在尿素存在條件下變復(fù)性時(shí)，使用本發(fā)明的方法制備的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子大大地減少了非目的蛋白的雜質(zhì)，純度高，生物活性好，可以作為治療藥物，具有良好的應(yīng)用前景。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，包括以下步驟：

(a)在大腸桿菌中表達(dá)并分離重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的包涵體；

(b)使用包涵體洗滌液洗滌所述包涵體；

(c)加入變性液溶解所述包涵體；

(d)加入復(fù)性液進(jìn)行包涵體復(fù)性；

(e)純化獲得重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子；

其中，所述步驟(d)采用碳酸氫銨作為緩沖液。

重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的包涵體可以采用商業(yè)化的或已知的大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)并分離。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(a)包括以下步驟：人神經(jīng)生長(zhǎng)因子氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，全基因合成人神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因，插入載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)，碎菌，離心，收集沉淀。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述載體為pET28a，所述大腸桿菌為大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)plyss，所述表達(dá)為IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，所述碎菌為超聲碎菌或勻漿機(jī)破碎等。