[發明專利]一種重組人神經生長因子的制備方法

在審

• 申請號: 201911325340.0
• 申請日: 2019-12-20
• 公開（公告）號: CN113004388A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 朱禎平;黃浩旻;肖建國
• 申請（專利權）人: 三生國健藥業（上海）股份有限公司
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/16;C12P21/02;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
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1.一種重組人神經生長因子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)在大腸桿菌中表達并分離重組人神經生長因子的包涵體；

(b)使用包涵體洗滌液洗滌所述包涵體；

(c)加入變性液溶解所述包涵體；

(d)加入復性液進行包涵體復性；

(e)純化獲得重組人神經生長因子；

其中，所述步驟(d)采用碳酸氫銨作為緩沖液。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(a)包括以下步驟：人神經生長因子氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，全基因合成人神經生長因子基因，插入載體，轉化大腸桿菌，表達，碎菌，離心，收集沉淀。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述載體為pET28a，所述大腸桿菌為大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)plyss，所述表達為IPTG誘導表達，所述碎菌為超聲碎菌或勻漿機破碎。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(b)包括以下步驟：使用包涵體洗滌液A重懸沉淀，超聲，離心，收集沉淀，其中，所述包涵體洗滌液A包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，0.5-3％Triton X-100，pH 8.0-8.5；使用包涵體洗滌液B重懸沉淀，超聲，離心，收集沉淀，其中，所述包涵體洗滌液B包括20-100mM Tris，50-150mMNaCl，1-10mM EDTA，1-4M尿素，pH 8.0-8.5；再使用包涵體洗滌液C重懸沉淀，超聲，離心，收集沉淀，其中，所述包涵體洗滌液C包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，pH8.0-8.5。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(b)包括以下步驟：使用包涵體洗滌液A重懸沉淀，超聲，離心，收集沉淀，重復該洗滌步驟一次，其中，所述包涵體洗滌液A包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100，pH 8.5；使用包涵體洗滌液B重懸沉淀，超聲，離心，收集沉淀，重復該洗滌步驟一次，其中，所述包涵體洗滌液B包括50mMTris，100mM NaCl，5mM EDTA，2M尿素，pH 8.5；再使用包涵體洗滌液C重懸沉淀，超聲，離心，收集沉淀，重復該洗滌步驟一次，其中，所述包涵體洗滌液C包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(c)包括以下步驟：在包涵體中加入變性液，所述變性液包括8M尿素和15-25mM檸檬酸，pH 2.8-3.2，所述包涵體與所述變性液按照濕重：體積為1：20-30比例加入變性液，溶解后離心去除沉淀。

7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述變性液包括8M尿素和20mM檸檬酸，pH3.0，所述包涵體與所述變性液按照濕重：體積為1：25比例加入變性液。

8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(d)包括以下步驟：在變性液中加入1/4體積0.8-1.0M碳酸氫銨pH8.0-9.0和8M尿素溶液，加入DTT至終濃度為5-10mM，25-37℃30-60min；再加入氧化型谷胱甘肽至終濃度為20-40mM，25-37℃10-15min；再加入19倍體積稀釋緩沖液，所述稀釋緩沖液包括50-150mM Na₂HPO₄，5-15mM乙醇胺，4.2-4.6M尿素，14-18％PEG300，pH8.3-8.5；再加入半胱氨酸至終濃度為1-5mM；用氬氣趕出空氣，4℃復性1-7天；用3K膜超濾濃縮復性液至rhNGF終濃度為1-2mg/ml。