[發明專利]在低氧性血睪屏障通透中作用機制的小鼠模型構建方法

有效

• 申請號: 201911321998.4
• 申請日: 2019-12-20
• 公開（公告）號: CN111066727B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 殷駿;倪兵;高鈺琪;廖衛公;鄧芳;柳君澤;高志奇;陳德偉;何文娟;趙力;張夢潔;唐中偉;陳建;劉寶;張二龍;徐剛;孫濱達;王澤軍;張健陽;李曉栩;周思敏;楊天;鐘志鳳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;A01K67/02;C12Q1/02
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發明屬于缺氧性血睪屏障通透作用機制技術領域，公開了一種在低氧性血睪屏障通透中作用機制的小鼠模型構建方法，建立低氧誘導C57BL/6和睪丸mTOR單基因敲除小鼠缺氧性血睪屏障通透模型，分離并收集mTOR基因敲除小鼠及C57BL/6小鼠曲精小管原代支持細胞系和小鼠支持細胞株，體外運用western blot、免疫細胞化學、qPCR等技術佐證mTOR對JAM?B調節作用的潛在分子機制。本發明明確缺氧抑制性活化的代謝平衡標記分子mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的保護作用及其對活化JAM?B的表達的分子機制，為治療缺氧性血睪屏障通透提供理論依據和治療策略。

技術領域

本發明屬于缺氧性血睪屏障通透作用機制技術領域，尤其涉及一種在低氧性血睪屏障通透中作用機制的小鼠模型構建方法。

背景技術

目前，最接近的現有技術：近年來移居青藏鐵路沿線的人口越來越多，高原缺氧(乏氧性缺氧)環境對男性移居者生殖功能有顯著負面影響，大量關于人類與大鼠精子生成數量減少現象已有報道。以上資料只是表明缺氧引起缺氧性精子生成減少(hypoxicspermatogenesis reduction,HSR)，但具體機制并不清楚。支持細胞之間血睪屏障(Blood-Testis-Barrier,BTB)是精子生成的重要屏障，其中緊密連接(Tight junction,TJ)分子通過及時的拆卸和重組，確保精母細胞通過BTB進入曲精小管腔，所以，如何維持血睪屏障TJ完整是精子生成順利進行的關鍵。在前期我們模擬海拔5000米低氧曝露小鼠60天，發現小鼠睪丸曲精小管中支持細胞BTB通透性顯著增加(hypoxic blood-testis-barrierpermeability,HBTBP)，進一步發現血睪屏障TJ分子mRNA與蛋白表達顯著下降，1％氧含量培養小鼠支持細胞48小時，發現小鼠支持細胞電阻顯著降低，TJ分子轉移至胞漿，且蛋白表達明顯降低。因此，低氧通過抑制小鼠TJ分子進而誘導血睪屏障通透，但是低氧抑制緊密連接分子的確切機制尚不清楚。

缺氧抑制緊密連接的機制在炎性腸病、酒精性脂肪肝、食管炎和缺血性腦卒中廣泛報道，其機制包括細胞內吞和降解緊密連接蛋白、緊密連接蛋白表達減少。但是缺氧抑制支持細胞緊密連接的機制尚不明確，查閱文獻也未見報道。我們前期研究發現缺氧抑制睪丸和支持細胞mTORC1(mechanistic Target Of Rapamycin complex 1)表達。mTORC1是細胞對外環境應激(如饑餓)作出反應并控制合成與分解代謝平衡的關鍵分子。在營養充足條件下，氨基酸激活Rheb-GTP，然后活化mTORC1。同時，氨基酸激活的RagA/B招募mTORC1聚集于溶酶體膜上。因此，以上兩個途徑共同激活mTORC1。激活后的mTORC1磷酸化TFEB(Transcription factor EB,堿性螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈轉錄家族成員)，磷酸化的TFEB不能結合CLEAR(Coordinated lysosomal expression and regulation,溶酶體合成相關基因的轉錄啟動區)元件。因此，溶酶體合成受限，最終導致內吞的胞外蛋白和胞膜上的緊密連接蛋白一起不能被溶酶體降解。饑餓條件下，mTOR從溶酶體膜上易位至胞漿并處于失活狀態。去磷酸化的TFEB結合CLEAR元件并誘導溶酶體合成，充足的溶酶體降解內吞的緊密連接蛋白并產生細胞所需的氨基酸。以上資料只是表明mTORC1從溶酶體膜上解離，酶活性降低，而非mTORC1表達減少。