[發(fā)明專利]在低氧性血睪屏障通透中作用機制的小鼠模型構建方法

有效

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• 申請日: 2019-12-20
• 公開（公告）號: CN111066727B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設計）人: 殷駿;倪兵;高鈺琪;廖衛(wèi)公;鄧芳;柳君澤;高志奇;陳德偉;何文娟;趙力;張夢潔;唐中偉;陳建;劉寶;張二龍;徐剛;孫濱達;王澤軍;張健陽;李曉栩;周思敏;楊天;鐘志鳳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;A01K67/02;C12Q1/02
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種在低氧性血睪屏障通透中作用機制的小鼠模型構建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

步驟一，使用睪丸特異性mTOR單基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠為對象；通過低氧誘導構建缺氧性血睪屏障通透模型，分析比較兩種小鼠的曲精小管病損情況和JAM-B表達水平；

步驟二，運用mTOR阻斷劑作為手段，將C57BL/6小鼠分為兩組；一組行mTOR阻斷劑處理；另一組以生理鹽水作為對照；比較兩處理組小鼠在低氧誘導后，曲精小管的病損程度及JAM-B的表達水平；

步驟三，分離mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持細胞作為研究對象；體外低氧暴露下，運用westernblot、免疫細胞化學、qPCR技術，比較刺激后兩組支持細胞分泌JAM-B的能力，體外佐證缺氧性血睪屏障通透模型中，mTOR抑制支持細胞表達JAM-B的調節(jié)作用和分子機制；

步驟四，體外低氧單獨或聯(lián)合mTOR單抗刺激小鼠曲精小管原代培養(yǎng)細胞系和小鼠支持細胞株TM4；比較兩刺激組間JAM-B的表達水平；

步驟五，在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR對JAM-B的活化作用；

步驟六，在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR作用后，運用野生型小鼠作為研究對象，使用mTOR重組蛋白體內促進mTOR表達，分析比較mTOR對缺氧性血睪屏障通透潛在的效果。

2.如權利要求1所述在低氧性血睪屏障通透中作用機制的小鼠模型構建方法，其特征在于，步驟五中，所述在明確缺氧性血睪屏障通透模型中mTOR對JAM-B的活化作用為：

①qPCR和WB明確小鼠睪丸和支持細胞TFEB表達水平，通過激活HBTBP小鼠睪丸和支持細胞TFEB來檢測JAM-B表達，佐證mTOR調節(jié)性誘導JAM-B是否依賴TFEB失活予以實現(xiàn)；

②通過WB提示mTOR激活后支持細胞HIF-1α活化程度顯著高于對照組支持細胞，并且HIF-1α結合JAM-B轉錄啟動子區(qū)缺氧反應元件的結果，實驗佐證mTOR調節(jié)性誘導JAM-B表達是否依賴HIF-1α激活予以完成。

3.如權利要求1所述在低氧性血睪屏障通透中作用機制的小鼠模型構建方法，其特征在于，所述明確mTOR在缺氧性血睪屏障通透中的作用的方法包括：

(1)建立低氧誘導的WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠缺氧性血睪屏障通透模型：

20至25g雄性小鼠采用11.5％氧含量低氧處理，每組共20只小鼠；分別于0、15、30、60天后分析小鼠的血睪屏障及曲精小管病損指標，根據(jù)指標初步斷定模型的建立是否成功；

(2)觀察WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧誘導之后的生理變化：

低氧誘導mTOR基因敲除小鼠和WT小鼠后開始觀察小鼠的活動狀況，并于0、15、30、60天四個時相點將兩組小鼠處死，分別收集兩組小鼠低氧誘導不同時間的小鼠附睪曲精小管組織和性腺組織，ELISA檢測兩組小鼠不同時間點PI3K/Akt/mTOR途徑指標Akt、RagA、Rhe B和mTORC1，觀察兩組小鼠曲精小管和性腺大體形態(tài)變化及HE染色、透射電鏡下曲精小管、性腺病理改變和血睪屏障結構改變，包括組織壞死程度，支持細胞和生殖細胞凋亡；

(3)分析mTOR阻斷劑在低氧誘導缺氧性血睪屏障通透中的作用：

將野生型小鼠分為兩組，一組體內注射mTOR阻斷劑，另一組體內注射生理鹽水后同時對兩組小鼠進行低氧誘導，比較兩組小鼠刺激0、15、30、60天四個時相點曲精小管和血睪屏障病損程度。

4.如權利要求1所述在低氧性血睪屏障通透中作用機制的小鼠模型構建方法，其特征在于，所述步驟三還包括體外明確mTOR對JAM-B的調節(jié)作用的方法，具體包括：

(1)分離野生型小鼠及mTOR基因敲除小鼠曲精小管支持細胞：小鼠曲精小管支持細胞的分離及培養(yǎng)、流式細胞技術檢測小鼠曲精小管支持細胞上mTOR的表達、體外檢測低氧誘導野生型及mTOR基因敲除小鼠原代細胞JAM-B的表達水平；

(2)體外檢測低氧和重組mTOR蛋白誘導細胞系后JAM-B表達水平：分別用單獨低氧和低氧+重組mTOR蛋白刺激細胞系，比較兩刺激組細胞。