[發(fā)明專利]一株枯草芽孢桿菌及其在生產(chǎn)γ-聚谷氨酸中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911316883.6
• 申請日: 2019-12-19
• 公開（公告）號: CN110904012B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫元軍;陸震;魏玉潔;陳雯雯;石艷麗;欒貽宏;郭學(xué)平
• 申請（專利權(quán)）人: 華熙生物科技股份有限公司;山東華熙海御生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/02;C12R1/125
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 賈波

本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌及其在生產(chǎn)γ?聚谷氨酸中的應(yīng)用，以枯草芽孢桿菌NT?11（Bacillus subtilis）CCTCC NO:M 2019383為發(fā)酵菌株，以谷氨酰胺為前體，同時(shí)通過發(fā)酵中期對pH、攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓、通風(fēng)量的調(diào)控，為發(fā)酵過程提供更加有益的條件，促進(jìn)菌體生長并合成超高分子量γ?聚谷氨酸。發(fā)酵液經(jīng)醇沉、復(fù)溶、離心、過濾、再醇沉、干燥等提取工藝獲得超高分子量γ?聚谷氨酸產(chǎn)品，經(jīng)檢測其分子量在3000kDa~6000kDa。本發(fā)明工藝簡單、易于操作、成本低、產(chǎn)率高，制得的聚谷氨酸純度較高、分子量明確、超高且相對穩(wěn)定可控，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），還涉及一種γ-聚谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，特別涉及一種超高分子量的γ-聚谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，屬于γ-聚谷氨酸制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，簡稱γ-PGA)是由L-谷氨酸(L-Glutamicacid)、D-谷氨酸(D-Glutamicacid)通過谷氨酸單體α-氨基和γ-羧基交聯(lián)結(jié)合形成的聚氨基酸化合物。它是一種無毒、對環(huán)境和人類無害的氨基酸聚合物，其分子量一般在100kDa～1000kDa之間，相當(dāng)于500~5000個(gè)左右的谷氨酸單體。γ-PGA主鏈上含有大量游離羧基，可發(fā)生交聯(lián)、螯合、衍生化等多種反應(yīng)，又具有強(qiáng)水溶性、生物相容性、生物降解性，及可食用、無免疫原性、安全無毒、易成膜等特性，因此作為一種新型綠色環(huán)保的生物材料，γ-PGA在醫(yī)藥、食品、化妝品、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用前景。

γ-PGA的生產(chǎn)方法目前主要有化學(xué)合成法、提取法、微生物發(fā)酵法等。化學(xué)合成法是將氨基酸逐個(gè)連接形成多肽，或者先將谷氨酸單體凝聚成谷氨酸二聚體后，再繼續(xù)由二聚體凝聚成高分子PGA。化學(xué)合成法是肽類合成的重要方法，但合成路線長、副產(chǎn)物多、收率低，尤其是含20個(gè)氨基酸以上的純多肽合成，因此對于γ-PGA的生產(chǎn)，此方法沒有太大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。提取法是從納豆等含有γ-PGA的產(chǎn)品中用乙醇將其分離提取出來。由于這些產(chǎn)品中所含的γ-PGA量較少，且提取工藝復(fù)雜、成本高，故不宜大規(guī)模生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法是在微生物的生長代謝過程中，γ-PGA作為一種代謝產(chǎn)物在細(xì)胞外積累的。與合成法、提取法相比，微生物發(fā)酵法具有簡單、易于操作、微生物生產(chǎn)快、發(fā)酵過程可調(diào)控、成本低等優(yōu)勢，是目前研究的熱點(diǎn)。

γ-PGA分子量越高，其粘性、吸水與保水性越強(qiáng)，應(yīng)用市場越廣，開發(fā)潛力越大。一般γ-PGA的分子量大多為100kDa～1000kDa，少數(shù)可達(dá)1000kDa~3000kDa。由于分子量越高，發(fā)酵液粘度越大，其流變性越難控制，發(fā)酵過程中溶解氧供給不足，加上發(fā)酵液中γ-PGA分解酶的作用，使γ-PGA的分子量不穩(wěn)定，多分散性，這給生產(chǎn)3000kDa以上超高分子量γ-PGA產(chǎn)品帶來難度。

針對高分子量γ-PGA的發(fā)酵生產(chǎn)，目前僅有少數(shù)報(bào)導(dǎo)。中國專利CN103667412A公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)高分子量γ-聚谷氨酸的方法，采用天津短桿菌和地衣芽孢桿菌混合發(fā)酵，由天津短桿菌發(fā)酵合成的谷氨酸可作為地衣芽孢桿菌合成γ-PGA的前體，可以在培養(yǎng)基中不添加谷氨酸，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高γ-PGA生產(chǎn)強(qiáng)度，降低生產(chǎn)成本。其缺點(diǎn)在于產(chǎn)品的分子量僅750kDa~1500kDa，且多菌種混合發(fā)酵工藝復(fù)雜，兩菌種協(xié)調(diào)生長時(shí)發(fā)酵條件不易控制，優(yōu)勢菌種在發(fā)酵過程中調(diào)控困難，產(chǎn)率不穩(wěn)定，若在工業(yè)中放大生產(chǎn)，還需進(jìn)一步研究。

中國專利CN103710404B公開了一種高分子量γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法，以地衣芽孢桿菌CGMCC NO.3336為出發(fā)菌株，通過對發(fā)酵過程中通風(fēng)、轉(zhuǎn)速、溫度的調(diào)控，特別是發(fā)酵后期依靠流加葡萄糖、氯化鈣、硫酸錳、硫酸鎂等料液，控制發(fā)酵pH并增加培養(yǎng)基離子強(qiáng)度，從而得到分子量1000kDa~4000kDa的γ-PGA，但是此方法所得產(chǎn)品的分子量范圍仍分散且偏小，在一定程度上無法滿足γ-PGA在高分子材料技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。