[發(fā)明專利]一種利用RPA-LFS快速檢測(cè)溶藻弧菌的特異性引物對(duì)以及試劑盒及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911312608.7
• 申請(qǐng)日: 2019-12-18
• 公開（公告）號(hào): CN111139307A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董井泉;酈娟;董宇;曾麗媚;趙盼盼;吉敬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇海洋大學(xué);連云港海恒生化科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 北京和聯(lián)順知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11621
• 代理人: 閆超良

本發(fā)明涉及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種利用RPA?LFS快速檢測(cè)溶藻弧菌的特異性引物對(duì)以及試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括特異性引物及探針、側(cè)流層析試紙條；所述下游引物5'端用生物素進(jìn)行標(biāo)記；所述探針5'端用異硫氰酸熒光橙紅(FITC)標(biāo)記，中間區(qū)域胞嘧啶脫氧核糖核苷用[THF]進(jìn)行替換，3'末端用DDC進(jìn)行末端封閉。優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明通過RPA?LFS實(shí)現(xiàn)快速低溫對(duì)溶藻弧菌進(jìn)行檢測(cè)，避免了傳統(tǒng)qPCR需要長(zhǎng)時(shí)間高溫的檢測(cè)方法，結(jié)果可用肉眼判讀，更加方便，適用于檢測(cè)進(jìn)出口水產(chǎn)品食品中溶藻弧菌，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病診斷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及溶藻弧菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用RPA-LFS快速檢測(cè)溶藻弧菌的特異性引物對(duì)以及試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

溶藻性弧菌為嗜鹽性弧菌之一，溶藻弧菌可感染多種海洋生物，對(duì)其致病或致死，給水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖行業(yè)帶來(lái)極大損失；同時(shí)溶藻弧菌對(duì)人體也有強(qiáng)致病性，近年來(lái)，由于溶藻弧菌造成的腹瀉，傷口感染和敗血癥等頻頻出現(xiàn)，已將其列入食品衛(wèi)生日常檢測(cè)與檢疫范疇。溶藻弧菌是條件致病菌，可在高溫天氣快速爆發(fā)，難以防控，因此快速便攜式的檢測(cè)體系對(duì)于溶藻弧菌檢測(cè)至關(guān)重要。

現(xiàn)有的溶藻弧菌進(jìn)行檢測(cè)的方法有生化鑒定法，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，但一般需要一周的時(shí)間；此外，還有免疫檢測(cè)技術(shù)包括ELISA與免疫膠體金層析技術(shù)，特異性高，靈敏度好，但是操作或制作過程復(fù)雜。也有分子檢測(cè)手段，包括多重PCR、定量PCR等，此類檢測(cè)依賴于精密控溫儀器，不易攜帶；近幾年也有一些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不以來(lái)溫控設(shè)備如LAMP技術(shù)，但是假陽(yáng)性高，結(jié)果不穩(wěn)定。

即存在以下問題：

1、現(xiàn)有溶藻弧菌檢測(cè)技術(shù)有PCR技術(shù)，但其要利用高溫打開雙鏈，降溫退火，再升溫延伸的過程，因此依賴于精準(zhǔn)的控溫設(shè)備，設(shè)備限制了該技術(shù)僅適用于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，且升降溫過程會(huì)造成檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)；

2、現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)有LAMP技術(shù)，結(jié)果驗(yàn)證依賴于瓊脂糖凝膠電泳或者樣品渾濁度。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果呈現(xiàn)梯形條帶，無(wú)法排除引物二聚體形成的梯形條帶；渾濁度判定依賴于主觀判斷，且無(wú)法判斷是否是有引物二聚體擴(kuò)增造成的樣品渾濁；

3、現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)還包括免疫膠體金試紙條，試紙條是一種作為一種簡(jiǎn)單方便靈敏的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)產(chǎn)品，已被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)行業(yè)，為廣大檢測(cè)人員所熟悉喜歡，但存在靈敏度不夠的問題；

為此，我們提出了一種利用RPA-LFS快速檢測(cè)溶藻弧菌的特異性引物對(duì)以及試劑盒來(lái)解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決背景技術(shù)中的問題，而提出的一種利用RPA-LFS快速檢測(cè)溶藻弧菌的特異性引物對(duì)以及試劑盒。

本發(fā)明涉及一種利用RPA-LFS快速檢測(cè)溶藻弧菌的特異性引物對(duì)，包括特異性引物對(duì)以及探針，特異性引物對(duì)包括：

上游引物：5’-AGCCCATTTTCTACTGACTCTAACACTGAC-3’

下游引物：5’-Biotin–GTTCGTGAATAACAATACGCAAACAGGAAG-3’

探針：

5-FITC-TCAAGTAGAGCCGACTAAAACTCAGCCGAA[THF]CCAGCATCTAACACG-DDC-3’。

本發(fā)明還涉及一種利用RPA-LFS快速檢測(cè)溶藻弧菌的試劑盒中，包含特異性引物對(duì)及探針、側(cè)流層析試紙條；所述下游引物5'端用異硫氰酸熒光素、6-羧基熒光、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、熒光基團(tuán)、生物素中的一種進(jìn)行標(biāo)記；