[發(fā)明專利]一種外周血中的腫瘤細(xì)胞株數(shù)量的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911305883.6
• 申請日: 2019-12-18
• 公開（公告）號: CN111458514A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王琦;曾勇
• 申請（專利權(quán)）人: 王琦;曾勇
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64;G01N15/14;G01N1/28;C12Q1/6841
• 代理公司: 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為;孟旭

1.一種外周血中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)外周血樣本的獲得

採用體表淺靜脈負(fù)壓采血法抽取靜脈血，

2)向外周血樣本注入已知數(shù)目的腫瘤細(xì)胞株及仿真人工合成熒光圓珠

3)采用以下技術(shù)對外周血腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集

采集人的外周血于任何一種含抗凝劑的采血管中，離心后，去掉血漿蛋白，向其中加入包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的單克隆抗體的磁珠后，顛倒混勻,室溫孵育，

加細(xì)胞緩沖液，輕輕將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到盛有細(xì)胞分離介質(zhì)上方隔離液的離心管，將樣品標(biāo)本再次離心，取上清液，將上清液再離心，棄去上清液，得到的沉積細(xì)胞即為富集的非血緣性有核細(xì)胞，

4)顯微鏡下辨認(rèn)及計數(shù)余下的腫瘤細(xì)胞株及熒光圓珠，得出細(xì)胞株及熒光圓珠的富集率。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)外周血樣本的獲得

採用體表淺靜脈負(fù)壓采血法抽取靜脈血，

2)向外周血樣本注入已知數(shù)目的腫瘤細(xì)胞株及仿真人工合成熒光圓珠

3)采用以下技術(shù)對外周血腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集

采集6ml人的外周血于任何一種含抗凝劑(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，NewJersey，USA)，離心(1000×g，15分鐘)后，去掉血漿蛋白，

向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的單克隆抗體的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，顛倒混勻10次,室溫孵育20分鐘，

加6毫升細(xì)胞緩沖液，輕輕將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到盛有3毫升的細(xì)胞分離介質(zhì)上方隔離液的離心管，將樣品標(biāo)本再次離心(900×g，6分鐘)，

取上清液，將上清液再離心1000×g，4分鐘，

棄去上清液，得到的沉積細(xì)胞即為富集的非血緣性有核細(xì)胞，

4)顯微鏡下辨認(rèn)及計數(shù)余下的腫瘤細(xì)胞株及熒光圓珠，得出細(xì)胞株及熒光圓珠的富集率。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)外周血樣本的獲得

採集6mL健康人外周血

2)向外周血樣本注入20-40顆仿細(xì)胞熒光圓珠及20-40顆細(xì)胞株

3)采用以下技術(shù)對外周血腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集及鑒別

離心(1000×g，15分鐘)后，去掉血漿蛋白，

向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的單克隆抗體的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，顛倒混勻10次,室溫孵育20分鐘，

加6毫升細(xì)胞緩沖液，輕輕將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到盛有3毫升的細(xì)胞分離介質(zhì)上方(該細(xì)胞分離介質(zhì)在20℃下的比重為1.07260～1.07650克/毫升，該細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅；多聚糖和泛影酸鈉；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物)隔離液的離心管，將樣品標(biāo)本再次離心(900×g，6分鐘)，

取上清液，將上清液再離心1000×g，4分鐘，

棄去上清液，得到的沉積細(xì)胞即為富集的細(xì)胞株，

對富集到的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，通過PE標(biāo)記的抗人CD45抗體(PE-anti-CD45)和DAPI對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，加上CEP8熒光探針對染色體線粒體的原位雜交

4)在顯微鏡下辨認(rèn)及計數(shù)富集后外周血中余下的仿細(xì)胞熒光圓珠及細(xì)胞株，根據(jù)計算公式計算圓珠回收率及細(xì)胞株回收率，熒光圓珠回收率與細(xì)胞株回收率應(yīng)該一致。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)外周血樣本的獲得

采集6mL受測者外周血

2)向外周血樣本注入20-40顆仿細(xì)胞熒光圓珠

3)采用以下技術(shù)對外周血腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集

離心(1000×g，15分鐘)后，去掉血漿蛋白，

向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的單克隆抗體的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，顛倒混勻10次,室溫孵育20分鐘，

加6毫升細(xì)胞緩沖液，輕輕將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到盛有3毫升的細(xì)胞分離介質(zhì)上方(該細(xì)胞分離介質(zhì)在20℃下的比重為1.07260～1.07650克/毫升，該細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的膠質(zhì)二氧化硅；多聚糖和泛影酸鈉；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非離子聚合物)隔離液的離心管，將樣品標(biāo)本再次離心(900×g，6分鐘)，

取上清液，將上清液再離心1000×g，4分鐘，

棄去上清液，得到的沉積細(xì)胞即為富集的細(xì)胞株，

對富集到的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，通過PE標(biāo)記的抗人CD45抗體(PE-anti-CD45)和DAPI對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，加上CEP8熒光探針對染色體線粒體的原位雜交，

4)在顯微鏡下辨認(rèn)及計數(shù)富集后外周血中余下的仿細(xì)胞熒光圓珠，根據(jù)圓珠回收率計算公式計算外周血中腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。