[發明專利]一株硫酸多粘菌素B單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用

在審

• 申請號: 201911305855.4
• 申請日: 2019-12-18
• 公開（公告）號: CN110923208A
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 胥傳來;李月;匡華;徐麗廣;馬偉;劉麗強;吳曉玲;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;C07K7/62;G01N33/68;C12R1/91
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一株硫酸多粘菌素B單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。本發明經篩選得到一株硫酸多粘菌素B單克隆抗體雜交瘤細胞株OVA17，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.18516。此細胞株分泌的單克隆抗體，對硫酸多粘菌素B具有較好的特異性和檢測靈敏度（IC₅₀值為13.13ng/mL），可實現對飼料及畜禽食品中硫酸多粘菌素B殘留量的檢測，為食品中硫酸多粘菌素B殘留的免疫檢測提供了原料，具有實際應用價值。

技術領域

本發明涉及一株硫酸多粘菌素B單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。

背景技術

硫酸多粘菌素B (多粘菌素B) 英文名：Polymyxin B Sulfate (PMB)，是由多粘芽胞桿菌產生的一組多肽類抗生素。PMB為白色結晶性粉末，易溶于水，有引濕性，在酸性溶液中穩定，其中性溶液在室溫放置一周不影響效價，在堿性溶液中不穩定。多粘菌素B抗菌譜及臨床應用與多粘菌素E相似，對革蘭氏陰性桿菌，如大腸桿菌、綠膿桿菌、副大腸桿菌、肺炎克雷白桿菌、嗜酸桿菌、百日咳桿菌及痢疾桿菌等有抑制或殺菌作用。臨床上主要用于敏感菌引起的感染及綠膿桿菌引起的泌尿系統感染、以及眼、氣管、腦膜炎、敗血癥、燒傷感染以及皮膚粘膜感染等。同時在畜禽養殖中也用作飼料添加劑，且有明顯促生長作用。

多粘菌素B、E一直用作抗菌藥物的最后一道防線。但是，在2016年中國首次報道了針對多粘菌素的耐藥性基因MCR-1，隨后MCR-1被報道存在于30多個國家和地區。據報道，早在1980年代中期，MCR-1就存在于大腸桿菌中，并且在動物飼料中使用粘菌素可能加速了MCR-1在動物中的傳播，隨后傳至人類。然而，由于粘菌素抗菌譜廣，促生長作用顯著，一些養殖者仍非法在飼料中添加粘菌素。因此，為了阻止MCR-1的傳播，維護消費者的利益，有必要建立一種針對PMB的可靠、高效、快速的檢測方法。酶聯免疫法（ELISA）具有前處理簡單，成本低，可實現大量樣品的現場快檢等優勢，但建立此方法的一個重要前提是需篩選出針對硫酸多粘菌素B的高特異性單克隆單體。

發明內容

本發明的目的是提供一株硫酸多粘菌素B單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，由該細胞株制備的抗體對硫酸多粘菌素B具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立硫酸多粘菌素B的免疫學檢測方法。

本發明的技術方案，一株硫酸多粘菌素B單克隆抗體雜交瘤細胞株OVA17，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏編號CGMCC No.18516。

硫酸多粘菌素B單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No.18516的硫酸多粘菌素B單克隆抗體雜交瘤細胞株OVA17分泌產生。

所述硫酸多粘菌素B單克隆抗體的應用，用于食品安全檢測中硫酸多粘菌素B殘留的分析檢測。

雜交瘤細胞株OVA17的制備方法：其通過硫酸多粘菌素B的完全抗原免疫小鼠后，經過培養篩選出兩種細胞融合后的雜交細胞；再經過間接競爭酶聯免疫法篩選細胞并三次亞克隆，得到雜交瘤細胞株OVA17。

本發明提供的硫酸多粘菌素B單克隆抗體雜交瘤細胞株OVA17的制備基本步驟為：

（1）半抗原的制備：半抗原PMB的結構式如下：

原藥 Mol. Wt: 1301.56

由于PMB化學結構式中含有多個活潑基團（氨基），因此本發明將原藥直接作為半抗原；

（2）完全抗原PMB-GMBS-BSA的制備：采用6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯（GMBS）雙功能交聯劑將PMB半抗原與載體蛋白偶聯以制備完全抗原。具體步驟為：