[發明專利]一種甘蔗黃葉病毒運動蛋白表達純化方法及其多克隆抗血清的制備

在審

• 申請號: 201911301623.1
• 申請日: 2019-12-17
• 公開（公告）號: CN110938645A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發明（設計）人: 韓成貴;張紹康;劉玉姿;王穎;張宗英;李大偉;于嘉林;王獻兵;張永亮
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/08;C07K16/10;G01N33/569
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本發明涉及一種甘蔗黃葉病毒運動蛋白(ScYLV?MP)表達純化方法以及ScYLV?MP多克隆抗血清的制備和檢測試劑盒的構建，其中ScYLV?MP表達純化步驟為：(1)ScYLV?MP基因的調取及擴增：(2)ScYLV?MP基因原核表達載體構建；(3)His?tag?(ScYLV?MP)融合蛋白的原核表達；(4)His?tag?(ScYLV?MP)融合蛋白的純化；(5)ScYLV?MP蛋白的獲得。采用本發明所述方法獲得的ScYLV?MP蛋白多克隆抗血清不僅準確率高、靈敏度高，而且特異性好，可實現甘蔗黃葉病毒及其運動蛋白的準確檢測，具有較大的應用價值和市場前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種檢測甘蔗黃葉病毒及其運動蛋白的血清學方法及其專用表達純化方法及其多克隆抗血清的制備。

背景技術

甘蔗黃葉病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)是侵染甘蔗的重要病毒，屬于黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)。該病毒具有韌皮部局限的特點，主要通過蚜蟲持久循回型和非增殖方式傳播。ScYLV侵染造成的損失主要是感病植株葉片黃化并生長減緩，最大減產可達50％。甘蔗作為我國主要糖料作物，其產生的蔗糖占我國食糖產量的90％以上，同時可生產乙醇，為新能源產業發展作出貢獻。近年來，甘蔗黃葉病毒引起的病害在我國主要甘蔗產區普遍發生，造成嚴重減產，從而對我國經濟發展、能源產業發展等多領域構成威脅。

ScYLV為正義單鏈RNA(+ssRNA)病毒，具有正二十面體球形病毒粒子，直徑約為25-30nm，由180個蛋白亞基按T＝3形成，包裹著基因組RNA，無包膜。ScYLV基因組全長約5.9kb，共含有6個開放閱讀框(ORFs)，編碼6個蛋白，前三個ORF通過基因組RNA表達，后三個通過亞基因組RNA表達，其中ORF4編碼甘蔗黃葉病毒運動蛋白(簡稱ScYLV-MP蛋白)，可定位在胞間連絲，在病毒復制和移動過程中發揮重要調節作用。

目前對于ScYLV的檢測，主要利用RT-PCR技術，據報道血清學技術主要利用ScYLV外殼蛋白制備的抗血清通過Western blot或ELISA進行檢測，然而利用運動蛋白制備抗血清檢測ScYLV尚未見正式報道。

發明內容

本發明首先提供一種甘蔗黃葉病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)運動蛋白(ScYLV-MP)表達純化方法，具體步驟為：

(1)ScYLV-MP基因的調取及擴增；

(2)ScYLV-MP基因原核表達載體構建；

(3)His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的原核表達；

(4)His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的純化。

其中，所述ScYLV-MP基因的調取及擴增是以含有ScYLV運動蛋白基因全長的克隆質粒為模板，以5'-CATATGTCAGAAGACGCGCTAACCGT-3'(下劃線為限制性內切酶Nde I的識別位點)和5'-CTCGAGTAAAGTCTTTCCCCCTG-3'(下劃線為限制性內切酶XhoI的識別位點)為引物進行PCR擴增；

其中，所述ScYLV-MP基因原核表達載體構建是將步驟(1)中得到的PCR擴增產物和克隆載體pMD19-T進行連接，得到重組質粒pMD19-T-ScYLV-MP，用限制性內切酶Nde I和XhoI進行酶切，回收酶切片段，取載體pDB.His.MBP，用限制性內切酶Nde I和Xho I進行酶切，回收載體骨架，將所述酶切片段和所述載體骨架進行連接，得到重組質粒pDB.His.MBP-ScYLV-MP；