[發(fā)明專利]一種甘蔗黃葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白表達(dá)純化方法及其多克隆抗血清的制備

在審

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• 申請日: 2019-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN110938645A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓成貴;張紹康;劉玉姿;王穎;張宗英;李大偉;于嘉林;王獻(xiàn)兵;張永亮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C07K14/08;C07K16/10;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種甘蔗黃葉病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)運(yùn)動(dòng)蛋白(ScYLV-MP)表達(dá)純化方法，具體步驟為：

(1)ScYLV-MP基因的調(diào)取及擴(kuò)增；

(2)ScYLV-MP基因原核表達(dá)載體構(gòu)建；

(3)His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的原核表達(dá)；

(4)His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的純化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述ScYLV-MP基因的調(diào)取及擴(kuò)增是以含有ScYLV運(yùn)動(dòng)蛋白基因全長的克隆質(zhì)粒為模板，以5'-CATATGTCAGAAGACGCGCTAACCGT-3'(下劃線為限制性內(nèi)切酶Nde I的識(shí)別位點(diǎn))和5'-CTCGAGTAAAGTCTTTCCCCCTG-3'(下劃線為限制性內(nèi)切酶Xho I的識(shí)別位點(diǎn))為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述ScYLV-MP基因原核表達(dá)載體構(gòu)建是將步驟(1)中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和克隆載體pMD19-T進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pMD19-T-ScYLV-MP，用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I進(jìn)行酶切，回收酶切片段，取載體pDB.His.MBP，用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I進(jìn)行酶切，回收載體骨架，將所述酶切片段和所述載體骨架進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pDB.His.MBP-ScYLV-MP。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的純化表達(dá)方法，其特征在于，所述His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的原核表達(dá)是將步驟(2)中獲得的原核表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌Rosseta中，得到重組菌Rosseta-ScYLV-MP，取Rosseta-ScYLV-MP單克隆，接種培養(yǎng)至OD_600nm值為0.6～0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，18℃、180rpm振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)18h，4℃、5000rpm離心6min，收集菌體沉淀，重懸后超聲破碎，收集上清液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的純化表達(dá)方法，其特征在于，所述His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的純化是將步驟(3)中獲得的上清與Ni親和層析柱結(jié)合，再用不同濃度咪唑洗脫液洗脫蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述純化表達(dá)方法所獲得的ScYLV-MP蛋白，其特征在于，所述ScYLV-MP蛋白具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述純化表達(dá)方法所獲得的ScYLV-MP蛋白在在制備多克隆抗血清中的應(yīng)用，其特征在于，所述ScYLV-MP蛋白具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

8.一種用于甘蔗黃葉病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)檢測的試劑盒，所述試劑盒包括：由權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述純化表達(dá)方法所獲得的ScYLV-MP蛋白所制備獲得的多克隆抗血清，所述ScYLV-MP蛋白具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。