[發明專利]基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制備方法

有效

• 申請號: 201911300610.2
• 申請日: 2019-12-17
• 公開（公告）號: CN111041025B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 胡勇;張苗苗
• 申請（專利權）人: 深圳市瑞吉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/87;C07K5/083;A61K48/00;A61K47/64
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

本發明提供了一種基于結合N?乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制備方法，含有啟動子、目的基因、特異性蛋白酶剪切序列、能結合N?乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列依次連接而成的DNA片段的質粒載體通過轉錄得到mRNA，在T4連接酶的作用下與DNA?嘌呤霉素連接體相連接，通過蛋白翻譯，并采用特異性蛋白酶進行剪切，得到mRNA?嘌呤霉素?GBD復合物，在N?乙酰半乳糖胺轉移酶作用下，與GBD蛋白序列結合形成mRNA?嘌呤霉素?GBD?GalNAc復合物，從而對mRNA進行GalNAc修飾，在mRNA藥物遞送過程中，達到精準給藥的目的，增加了mRNA藥物分子的藥效。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制備方法。

背景技術

去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是數量豐富的一種異源低聚物的內吞型受體，主要存在于肝臟實質細胞朝向竇狀隙一側的細胞膜表面，具有對糖的特異性，是肝細胞特異性表達的一種內吞型受體。近年來，利用ASGPR的高親和性配體N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)作為靶向分子，在核酸藥物，如小干擾RNA(Small interferingRNA，siRNA)的肝靶向遞送方面取得了突破性進展。盡管該受體已被發現多年，但基于該受體及其配體的信使RNA(Messenger RNA,mRNA)遞送系統未能取得突破，原因在于，現有技術手段無法實現mRNA與GalNAc的有效耦合。

目前，mRNA向細胞內的遞送可以通過不同的方法實現，例如電穿孔，聲孔效應，顯微注射或基于高分子化合物的細胞轉染，但這些方法對細胞是相對有毒的，臨床轉化具有一定難度。

發明內容

針對以上技術問題，本發明公開了基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制備方法，通過全新的mRNA合成與修飾策略，實現對成熟mRNA分子的GalNAc修飾，從而實現mRNA肝臟靶向性藥物遞送對創新基礎研究、新型藥物設計與開發均具有十分重要的意義。

對此，本發明采用的技術方案為：

一種用于構建基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段包括啟動子、目的基因、特異性蛋白酶剪切序列、能結合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD(GlaNAc Binding Domain,GBD)序列依次連接而成。

采用此技術方案，該DNA片段可以用于構建基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子。

作為本發明的進一步改進，所述GBD序列為SEQ ID No.1-5中的一種或幾種的組合。

作為本發明的進一步改進，所述目的基因的序列如SEQ ID No.6或7所示。其中，所述的目的基因可以替換為其他的基因，可以根據治療不同的疾病進行選擇相應的目的基因。

作為本發明的進一步改進，所述特異性蛋白酶剪切序列為帶有GBD序列的T2A、P2A、E2A、F2A、TEV、VLP1和/或SUMO特異性蛋白酶酶切序列中的一種或幾種。

作為本發明的進一步改進，所述啟動子為T3或T7或SP6啟動子。

本發明還公開了一種基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子，其包括mRNA分子，所述mRNA分子為采用包含如上所述的DNA片段的質粒通過體外轉錄得到，所述mRNA分子的序列依次包含5’帽子、目的基因序列、特異性蛋白酶剪切序列、多肽GBD蛋白；所述多肽GBD蛋白為所述GBD序列通過核糖體翻譯得到；所述mRNA分子的GBD序列端通過嘌呤霉素連接GBD蛋白，所述GBD蛋白通過酶催化反應連接N-乙酰半乳糖胺。