[發明專利]基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制備方法

有效

• 申請號: 201911300610.2
• 申請日: 2019-12-17
• 公開（公告）號: CN111041025B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 胡勇;張苗苗
• 申請（專利權）人: 深圳市瑞吉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/87;C07K5/083;A61K48/00;A61K47/64
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

1.基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子，其特征在于：其包括mRNA分子，所述mRNA分子采用DNA片段的質粒通過體外轉錄得到，所述mRNA分子的序列依次包含5’帽子、目的基因序列、特異性蛋白酶剪切序列、多肽GBD蛋白序列；多肽GBD蛋白為所述多肽GBD蛋白序列通過核糖體翻譯得到；所述mRNA分子的GBD序列端通過嘌呤霉素連接體連接GBD蛋白，GBD蛋白通過酶催化反應連接N-乙酰半乳糖胺；

所述DNA片段包括啟動子、目的基因、特異性蛋白酶剪切序列、能結合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列依次連接而成；

所述GBD序列如SEQ ID No.2所示；

所述目的基因的序列如SEQ ID No.6或7所示；

所述特異性蛋白酶剪切序列為Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)，如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；

所述啟動子為T3或T7或SP6啟動子；

所述嘌呤霉素連接體的序列如SEQ ID No.8所示。

2.一種如權利要求1所述的基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟S1，根據所遞送的組織、器官或細胞選取特異性細胞表面受體，并設計能結合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列，并將啟動子序列、目的基因序列、特異性蛋白酶剪切序列、GBD序列組合克隆到質粒載體中，得到質粒DNA；

步驟S2，以步驟S1的質粒DNA為模板進行體外轉錄，得到含有5’帽子、目的基因序列、特異性蛋白酶剪切序列、GBD序列的mRNA序列；

步驟S3，在T4連接酶的作用下，所述mRNA分子與DNA-嘌呤霉素連接體結合，并形成mRNA-嘌呤霉素復合體；

步驟S4，將步驟S3得到的mRNA-嘌呤霉素復合體進行體外翻譯，所述mRNA-嘌呤霉素復合體被核糖體翻譯出基因功能蛋白-特異性蛋白酶剪切序列-GBD的融合蛋白序列；

步驟S5，翻譯結束時，嘌呤霉素通過核糖體A位連接到所述融合蛋白序列的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-特異性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白復合物；

步驟S6，對步驟S5得到的產物采用特異性蛋白酶進行剪切，mRNA-嘌呤霉素-GBD-特異性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白復合物中特異性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-GBD復合物；

步驟S7，在N-乙酰半乳糖胺轉移酶作用下，N-乙酰半乳糖胺特異性的與GBD蛋白序列結合，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc復合物；

步驟S3中所述DNA-嘌呤霉素連接體的序列如SEQ ID No.8所示；

步驟S6中特異性蛋白酶為Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)，如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。

3.根據權利要求2所述的基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的制備方法，其特征在于：步驟S1中，所述質粒載體改造自pCDNA3.1。

4.一種如權利要求1所述的基于結合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的應用，其特征在于：用于制備特異性遞送的mRNA藥物中，3’端連接有N-乙酰半乳糖胺，通過N-乙酰半乳糖胺與肝臟細胞表面唾液酸糖蛋白受體特異性結合引物細胞內吞，從而使mRNA進入細胞進行表達。