[發(fā)明專利]用于熒光定量PCR檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911299218.0
• 申請日: 2019-12-16
• 公開（公告）號: CN110819709A
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 刁久玲;翟瑞雪;智慧芳;倪君君
• 申請（專利權(quán)）人: 北京和合醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京雙收知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 解政文

本發(fā)明提供一種用于熒光定量PCR檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的引物探針組合，包括三組引物和雙探針如序列表所示；同時提供一種熒光定量PCR檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的方法。本發(fā)明采用實時熒光定量PCR Taqman?MGB探針的方法檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性，并且采用了野生型與突變型雙探針的檢測方法，不但提高了特異性，還降低了成本；Taqman?MGB探針在實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、特異性、靈敏度等方面均優(yōu)于普通的探針。因此，本發(fā)明建立的CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的方法存在結(jié)果準(zhǔn)確、特異性靈敏度高、無毒害無污染、成本低廉、快速高效等優(yōu)點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及用于熒光定量PCR檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的引物探針組合及檢測方法。

背景技術(shù)

華法林是目前臨床上廣泛使用的維生素K拮抗劑類口服抗凝血藥，用于靜脈血栓栓塞、心肌梗死、缺血性腦卒中、心臟瓣膜置換術(shù)后、房顫等的抗凝治療和預(yù)防。目前臨床使用的華法林制劑是S-華法林和R-華法林的消旋體混合物，其中S-華法林的抗凝活性是R-華法林的2.7～3.8倍，在體內(nèi)主要由肝臟細(xì)胞色素P450 2C9(CYP2C9)進(jìn)行代謝。CYP2C9基因編碼區(qū)存在著單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNPs)，其中比較重要的是CYP2C9*2和CYP2C9*3，具有這兩種突變的個體所需華法林劑量明顯降低，出血的風(fēng)險也隨之增加。另外，維生素K環(huán)氧化物環(huán)氧化酶復(fù)合體1(VKORC1)是體內(nèi)維生素K依賴性凝血因子生成的限速酶，華法林可競爭性抑制此酶的作用而達(dá)到抗凝效果。因此在臨床用藥過程中，應(yīng)首先對患者進(jìn)行CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性檢測，再加上年齡、性別和體重解釋約61％的華法林個體用藥差異。目前，根據(jù)不同基因型和年齡、體重的組合來調(diào)節(jié)華法林個體化用藥的劑量公式已經(jīng)比較完善。

目前，對于CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性檢測的方法有很多種，如直接測序法、焦磷酸測序法、實時熒光定量PCR(QPCR)、等位基因特異性擴(kuò)增法(ARMS)等。其中，最常用的測序法能夠直接檢測突變位點的位置和類型，但該方法操作步驟繁瑣，檢測周期長，靈敏度低，且擴(kuò)增產(chǎn)物容易產(chǎn)生污染。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述缺陷，本發(fā)明的技術(shù)目的是提供用于熒光定量PCR檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的引物探針組合及檢測方法，該方法運用引物與雙探針組合的檢測方法，具有結(jié)果準(zhǔn)確、特異性靈敏度高、無毒害無污染、成本低廉、快速高效等優(yōu)點。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種用于熒光定量PCR檢測CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性的引物探針組合，包括三組引物和雙探針，其中：第一組引物探針的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.1所示，下游引物由SEQ ID NO.2所示，熒光探針1由SEQ ID NO.3所示，熒光探針2由SEQ ID NO.4所示；第二組引物探針的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.5所示，下游引物由SEQ ID NO.6所示，熒光探針1由SEQ ID NO.7所示，熒光探針2由SEQ ID NO.8所示；第三組引物探針的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.9所示，下游引物由SEQ ID NO.10所示，熒光探針1由SEQ ID NO.11所示，熒光探針2由SEQ IDNO.12所示。