[發明專利]一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)2

在審

• 申請號: 201911298986.4
• 申請日: 2019-12-17
• 公開（公告）號: CN110903387A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 郝曉寒;吳健敏;崔尚金;劉秀麗;梁琳;劉金鳳;覃紹敏;白安斌;馬玲;陳鳳蓮;秦樹英;楊磊
• 申請（專利權）人: 吉林省紐卓萊生物科技有限責任公司;廣西壯族自治區獸醫研究所;中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06;C07K1/22;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 廣西中知科創知識產權代理有限公司 45130
• 代理人: 李家恒

本發明提供一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂及其制備方法和應用，屬于免疫學及基因工程領域。以北京地區分離鑒定的犬冠狀病毒BJ02為基礎毒株制備犬冠狀病毒滅活疫苗，按一定程序免疫健康牛，定期采血監測抗體水平，產生高效價抗體后收集高免血，加入青霉素和鏈霉素，自然凝固分離高免血清，采用硫酸銨沉淀法分離高免血清中的免疫球蛋白，以胃蛋白酶酶切Fc’片段后，Protein A+G柱純化回收獲得高活性免疫球蛋白F(ab′)₂。本發明制備的F(ab′)₂特異性強，可作為犬接觸感染犬冠狀病毒時的緊急預防和治療制劑，增加病犬機體免疫力和病毒抵抗力，具有效價高、安全性好、無臨床副作用，具有良好的推廣應用前景。

技術領域

本發明涉及免疫學及基因工程領域，具體一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂及其制備方法和應用。

背景技術

犬冠狀病毒病是由犬冠狀病毒(CCV)引起的，以犬胃腸炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病。該病毒最早在1971年從德國腹瀉的軍犬中分離獲得，之后在世界各地相繼有報道。1985年以來，我國也陸續出現CCV的報道。CCV可主要感染犬科動物，各年齡、品種、性別的犬均可感染，其中2-4月齡的幼犬發病率和死亡率最高，其它種屬動物，如貓、大熊貓、小熊貓、狐、狼和豬等均有易感性。CCV感染主要以嘔吐、腹瀉、精神沉郁、脫水為主要臨床特征，既可單獨感染，也可與犬細小病毒、腺病毒、輪狀病毒等病原混合感染或繼發感染，與其它病原混合感染時，臨床癥狀表現嚴重，死亡率會明顯增高。

目前，疫苗接種是預防犬冠狀病毒感染最常用且最有效的手段，對于發病動物，尚無特效治療藥物，臨床上常采用對癥治療，支持療法、特異療法、控制繼發感染進行綜合治療。特異性抗病毒治療普遍使用全冠狀病毒免疫血清，利用血清中的抗體特異性識別病毒表面抗原，中和病原體。雖然抗犬冠狀病毒免疫血清應用取得了較好的治療效果，但因犬血液含量有限，犬源CCV免疫血清制備成本較高，并且，直接使用犬源免疫血清，可能會因其純度問題易造成動物產生不良反應，同時還可能會因血清中含有其它病原而導致某些傳染病的擴散傳播，因此開發高純度異源CCV抗體成了治療犬冠狀病毒的最佳選擇之一。目前，國內對異源犬冠狀病毒治療抗體相關研究較少。本研究大量制備牛源抗犬冠狀病毒高免血清，提取和純化高效價F(ab′)₂抗體，用于犬冠狀病毒疾病的預防和治療，具有重要的現實意義。

發明內容

本發明的發明目的之一是，針對上述問題，提供一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂，以犬冠狀病毒免疫健康牛，制備了牛源免疫球蛋白F(ab′)₂，具有效價高、安全性好、無臨床副作用，具有良好的推廣應用前景。

為達到上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂，先采用犬冠狀病毒滅活疫苗免疫健康牛，采集血分離高免血清，然后從高免血清中分離純化IgG，經胃蛋白酶酶切，將酶切產物過親和層析柱，收集洗脫液，過濾，除菌得犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂。

優選的，所述犬冠狀病毒為犬冠狀病毒BJ02。

優選的，所述的犬冠狀病毒滅活疫苗的制備方法為：將犬冠狀病毒BJ02在MDCK細胞上擴大培養后，以47份的滅活的犬冠狀病毒與4份的吐溫-80及終濃度為0.3mg/mL胸腺肽制備水相，94份白油與2份硬脂酸鋁及6份司本80制備油相，油相與水相混合乳化后制成油乳滅活苗，疫苗中病毒含量≥10⁵TCTD₅₀/0.1mL。