[發(fā)明專利]一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)2

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911298986.4
• 申請日: 2019-12-17
• 公開（公告）號: CN110903387A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設計）人: 郝曉寒;吳健敏;崔尚金;劉秀麗;梁琳;劉金鳳;覃紹敏;白安斌;馬玲;陳鳳蓮;秦樹英;楊磊
• 申請（專利權）人: 吉林省紐卓萊生物科技有限責任公司;廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所;中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06;C07K1/22;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 廣西中知科創(chuàng)知識產權代理有限公司 45130
• 代理人: 李家恒

1.一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制備方法，其特征在于，先采用犬冠狀病毒滅活疫苗免疫健康牛，采集血分離高免血清，然后從高免血清中分離純化IgG，經胃蛋白酶酶切，將酶切產物過親和層析柱，收集洗脫液，過濾，除菌得犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂。

2.根據權利要求1所述的一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制備方法,其特征在于，所述犬冠狀病毒為犬冠狀病毒BJ02。

3.根據權利要求1所述的一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制備方法,其特征在于，所述的犬冠狀病毒滅活疫苗的制備方法為：將犬冠狀病毒BJ02在MDCK細胞上擴大培養(yǎng)后，以47份的滅活的犬冠狀病毒與4份的吐溫-80及終濃度為0.3mg/mL胸腺肽制備水相，94份白油與2份硬脂酸鋁及6份司本80制備油相，油相與水相混合乳化后制成油乳滅活苗，疫苗中病毒含量≥10⁵TCTD₅₀/0.1mL。

4.根據權利要求1所述的一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制備方法,其特征在于，所述采用犬冠狀病毒滅活疫苗免疫健康牛的免疫程序為：首次以肌肉多點及交會穴注射3-5mL的犬冠狀病毒滅活疫苗，進行基礎免疫，間隔7天后同樣方式注射3-5mL犬冠狀病毒滅活疫苗進行第一次加強免疫，第一次加強免疫后間隔7天進行下一次加強免疫，以后每間隔7天進行下一次加強免疫，免疫劑量逐次遞增0.5-1mL。

5.根據權利要求4所述的一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制備方法,其特征在于，加強免疫后持續(xù)監(jiān)測犬冠狀病毒抗體效價，當效價達到2⁵時開始采血。

6.根據權利要求5所述的一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制備方法,其特征在于，加強免疫后持續(xù)監(jiān)測犬冠狀病毒抗體效價，當效價達到最高峰時開始大量采血。

7.根據權利要求1所述的一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制備方法,其特征在于，分離純化IgG具體包括以下步驟：

(1)向采集的血液加入200單位/mL的青霉素和100ug/mL鏈霉素，4℃下靜置8-12h后收集血清；

(2)向血清中先后加入2倍體積的0.06M，pH4.2的PBS和1/20體積的正辛酸充分混勻后離心收集上清液；

(3)向所述上清液加入0.227g/mL硫酸銨，放置8-12h后離心收集沉淀；

(4)將沉淀溶解于PBS，再加入硫酸銨至溶液中硫酸銨飽和度為35％，離心再次收集沉淀，最后將沉淀溶解于原血清等體積的PBS中，透析，離心去除沉淀獲得IgG。

8.根據權利要求1所述的一種犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂的制備方法,其特征在于，將分離純化的IgG的pH調整為3-4，加入10-20μg/mg胃蛋白酶，30-37℃消化1-3h后收集酶切溶液進行Protein A+G親和層析柱純化，過濾除菌后即為犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂。

9.根據權利要求1-8任一所述的方法制備的犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂。

10.根據權利要求9所述的犬冠狀病毒免疫球蛋白F(ab′)₂在制備用于預防和/或治療犬冠狀病毒病藥物中的應用。