[發(fā)明專利]一種小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及其3D分化培養(yǎng)物模型的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911291748.0
• 申請(qǐng)日: 2019-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN110951672B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李暉;陳紅;張蔚;夏思雨;葉立娜;吳明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發(fā)明公開了一種小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及其3D分化培養(yǎng)物模型的構(gòu)建方法。該小鼠正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的命名為MNUEC/HL?027，其保藏編號(hào)為CCTCC No：C2015108。同時(shí)提供了所述小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞3D分化培養(yǎng)物模型的構(gòu)建方法：2D培養(yǎng)基重懸單細(xì)胞，接種到氣液培養(yǎng)裝置中，2D培養(yǎng)基更換為3D分化培養(yǎng)基培養(yǎng)14～21天。小鼠子宮內(nèi)膜上皮3D分化培養(yǎng)物分化完全后，具有與正常子宮內(nèi)膜組織相似的結(jié)構(gòu)特征，形成由上皮細(xì)胞構(gòu)成的假?gòu)?fù)層結(jié)構(gòu)，包括基底層和功能層。同時(shí)也具有與正常小鼠子宮內(nèi)膜組織相同的特異性蛋白標(biāo)志物和細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)特點(diǎn)，具有結(jié)構(gòu)功能性，可用于子宮內(nèi)膜組織的生理學(xué)研究和再生修復(fù)的功能性研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及其3D分化培養(yǎng)物模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

子宮內(nèi)膜是一種高度再生組織，長(zhǎng)期處于增生、分化和脫落的動(dòng)態(tài)循環(huán)中，子宮內(nèi)膜分為基底層和功能層，其中功能層的組成包括了海綿層與致密層，研究表明子宮內(nèi)膜組織中存在一小群具有強(qiáng)大增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞，可不斷分裂增殖，及時(shí)補(bǔ)充脫落的終末分化細(xì)胞，使其始終保持自我更新和再生能力，在生殖活動(dòng)中占有重要地位。隨著組織工程學(xué)和細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子水平的發(fā)展，體外構(gòu)建組織工程化子宮片層或其3D分化培養(yǎng)物為進(jìn)一步研究子宮疾病和胚胎著床提供了更多理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇。為獲得大量的、高純度的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)子宮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法進(jìn)行了大量研究。1989年研究者根據(jù)細(xì)胞沉降速度不同分離得到子宮細(xì)胞，2001年研究者采用200目、350目的濾網(wǎng)過濾2次可獲得純度較高的人子宮細(xì)胞，1992年Fernandez-Shaw將懸浮的子宮內(nèi)膜細(xì)胞吸附在用抗體包被的免疫磁珠上也可成功分離子宮細(xì)胞，但以上方法都有不足，分離的子宮內(nèi)膜細(xì)胞在體外無(wú)法穩(wěn)定增殖培養(yǎng)，在產(chǎn)量和純度上也有待提高。

目前，從動(dòng)物或人活體組織樣品中獲得的上皮細(xì)胞產(chǎn)量仍然很低(包括子宮內(nèi)膜細(xì)胞)，其中細(xì)胞的數(shù)量、直接分離或短期培養(yǎng)的細(xì)胞純度都比較低，這些原代和傳代上皮細(xì)胞的增殖速度也極為有限，例如有的只能進(jìn)行短期的原代培養(yǎng)，有的只能進(jìn)行有限的傳代培養(yǎng)(2～3代)，影響大批量開展實(shí)驗(yàn)研究。為了在體外進(jìn)行上皮細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，目前國(guó)內(nèi)外大多通過遺傳操作，如轉(zhuǎn)入病毒或細(xì)胞癌基因延長(zhǎng)體外細(xì)胞存活的代數(shù)。但是遺傳操作的最大缺點(diǎn)是會(huì)改變這些細(xì)胞的遺傳背景和表型，以致讓這些正常上皮細(xì)胞丟失其正常生理功能，因此這些細(xì)胞也不具備正常分化功能。

上皮組織層具有一定的極性，從而形成了兩個(gè)不同的表面：頂端面和基底外側(cè)面。頂端面主要面對(duì)外環(huán)境，而基底面則是接觸底層細(xì)胞以及全身脈管系統(tǒng)，其形態(tài)學(xué)及分化程度在子宮內(nèi)膜及相關(guān)功能修復(fù)機(jī)制研究中至關(guān)重要。近年來(lái)，女性子宮內(nèi)膜過薄現(xiàn)象逐年嚴(yán)重，宮腔粘連發(fā)病率也居高不下，已經(jīng)成為體外受精—胚胎移植中周期取消和種植失敗的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在分泌期的集落形成能力強(qiáng)，推斷子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞具有子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的特性，在子宮內(nèi)膜周期性脫落和增長(zhǎng)中起到關(guān)鍵作用。目前，利用常規(guī)二維的細(xì)胞培養(yǎng)模型來(lái)探索子宮內(nèi)膜再生及相關(guān)功能修復(fù)機(jī)制研究始終存在著明顯的局限性。因此，建立穩(wěn)定的更接近子宮內(nèi)環(huán)境及生理狀態(tài)的三維子宮內(nèi)膜上皮3D分化培養(yǎng)物模型意義重大。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的首要目的是提供一種小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。該子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞具有傳代穩(wěn)定、存活率高的特點(diǎn)，具有譜系分化潛能、正常DNA損傷修復(fù)功能，沒有錨定-非依賴性生長(zhǎng)的能力。

為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

提供一種小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，該細(xì)胞命名為小鼠正常子宮上皮細(xì)胞MNUEC/HL-027，已于2016年8月11日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編：430072，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為CCTCC No：C2015108。