[發明專利]一種小鼠子宮內膜上皮細胞及其3D分化培養物模型的構建方法

有效

• 申請號: 201911291748.0
• 申請日: 2019-12-16
• 公開（公告）號: CN110951672B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 李暉;陳紅;張蔚;夏思雨;葉立娜;吳明
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種小鼠子宮內膜上皮細胞，其特征在于，所述細胞命名為小鼠正常子宮上皮細胞MNUEC/HL-027 ，保藏編號為CCTCC No：C2015108。

2.一種基于權利要求1所述小鼠子宮內膜上皮細胞的3D分化培養物模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）將0.4μM的Millicell PCF 內置物放入六孔板中，每孔最多放三個內置物;

（2）用400μ1小鼠子宮內膜上皮細胞2D培養基重懸5×10⁵個的小鼠子宮上皮細胞MNUEC/HL-027，然后接種到每個內置物中；

（3）每個孔板內部即內置物外圍加入2ml的2D培養基；

（4）將放有內置物的六孔板放入培養箱中，37℃，5% CO₂培養時長為48小時；

（5）將內置物內部及外部中的培養基更換為3D分化培養基；

所述小鼠子宮內膜上皮細胞2D培養基的配制：DMEM與Ham' s F 12 NUTRIENT MIX按體積比3 : 1 混合的培養基，同時添加4～6 %胎牛血清、1～3 n M 三腆甲狀腺氨酸，0.4～0.65%胰島素鐵曬傳遞蛋白試劑、4～6μg/ml鐵傳遞蛋白、9～11ng/mL表皮生長因子、0.3～0.5μg/mL氫化可的松、35～45μg/mL慶大霉素、45～55nM calpeptin、35～45ng/ml重組人IL-lRA，3μg/ml重組人R-Spondin-1以及1-100 ng/ml 人胎盤催乳素；

所述3D分化培養基的配制：DMEM與F12按體積比1:1混合的培養基，同時添加0.5～1.2μM胰島素、0.05～0.2μM鐵傳遞蛋白,0.05～0.15μM氫化可的松,0.005～0.015μM三腆甲狀腺氨酸, 1～4μM腎上腺素, 0. 1～1ng/mL表皮生長因子，2～8×10^-8 M視黃酸, 0 .1～1μM磷酸乙醇胺, 0.1～1μM氨基乙醇, 1～5μM硫酸鋅, 100 U/mL青霉素G硫酸, 100μg/mL鏈霉素硫酸鹽,0.5～1.5 mM氯化鈣，1-50 nM beta-雌二醇, 0.1-10 ug/ml 人絨毛膜促性腺激素, 1-100 ng/ml人胎盤催乳素；

（6）將放有內置物的培養板放入培養箱中，培養15～17小時，使insert內部的細胞與細胞之間形成緊密連接；

（7）移除內置物內部及外圍所有的培養基，外部的培養皿中加入3D分化培養基，開始分化培養；

（8）在培養箱中培養小鼠子宮上皮細胞14～21天，培養條件為37℃， 5% CO₂，每2～3天更換內置物外圍的3D分化培養基。

3.權利要求2所述的基于權利要求1所述的小鼠子宮內膜上皮細胞3D分化培養物模型的構建方法制得的小鼠子宮上皮細胞3D分化培養物模型。

4.權利要求3所述的小鼠子宮內膜上皮細胞3D分化培養物模型在制備子宮內膜損傷修復的藥物中的應用，其特征在于，所述小鼠子宮內膜上皮細胞3D分化培養物模型用于篩選子宮內膜損傷修復的藥物。