[發明專利]一種利用細胞質和細胞核分子標記創制香菇栽培菌株核質雜交種的方法

有效

• 申請號: 201911290279.0
• 申請日: 2019-12-16
• 公開（公告）號: CN110904262B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 宋曉霞;陳明杰;趙妍;宋春艷;譚琦;章爐軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12N15/04;A01H15/00;C12R1/645
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

1.一種利用細胞質和細胞核分子標記創制香菇栽培菌株核質雜交種的方法，其特征在于：

包括下列步驟：

步驟1：rrnL基因序列測定，確定第一種香菇的細胞質類型

將第一種香菇的菌絲加入容納有裂解液的離心管中，在混勻儀上混勻，得到菌絲裂解液，然后以所述菌絲裂解液為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為：菌絲裂解液1μL、rrnL基因上游引物0.5 μL、rrnL基因下游引物0.5 μL、PCR Mix 3.0 12.5 μL、無菌 ddH₂O 10.5 μL；PCR反應流程為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55 ℃退火30 s，72℃延伸50s，35個循環；72 ℃終延伸7 min；

所述rrnL基因上游引物為：5’-ATTGTCTCGGTGGTTTGGCA-3’，所述rrnL基因下游引物為：5’-CGCTTTTTAAGTTCCCCGATG T-3’；

PCR結果檢測及測序：擴增結束后，將PCR反應產物在瓊脂糖凝膠電泳上檢測、切膠，用膠回收試劑盒回收特異性片段，連接至克隆載體中，然后轉入感受態細胞，經藍白斑篩選，每個菌絲挑取5個克隆子進行測序；

rrnL基因分析及細胞質類型確定：用SeqMan軟件合并同一菌絲的rrnL基因，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的堿基；將獲得的rrnL基因序列與4個線粒體基因組的rrnL相同位置的基因序列進行同源比對，所用軟件為MEGA v7.0，構建的系統發育樹為鄰接樹；若該rrnL基因序列與哪個線粒體的rrnL相同位置的基因序列同源性高，則認為該菌絲與同源性高的線粒體基因組屬于同一個基因組類型；

步驟2：ITS2序列測定，確定第二種香菇的細胞核類型

將第二種香菇的菌絲加入含有裂解液的離心管中，在混勻儀上混勻，得到菌絲裂解液，然后以所述菌絲裂解液為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為：菌絲裂解液1μL、ITS上游引物0.5 μL、ITS下游引物0.5 μL、PCR Mix 3.0 12.5 μL、無菌 ddH₂O 10.5 μL；PCR反應流程為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55 ℃退火30 s，72℃延伸50s，35個循環；72 ℃終延伸7min；

所述ITS上游引物為通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，所述ITS下游引物為通用引物ITS4：5’- TCCTCCGCT TAT TGA TATGC-3’；

PCR結果檢測及測序：擴增結束后，將PCR反應產物在瓊脂糖凝膠電泳上檢測、切膠，用膠回收試劑盒回收特異性片段，連接至克隆載體中，然后轉入感受態細胞，經藍白斑篩選，每個菌絲挑取10個克隆子進行測序；

ITS2序列分析及細胞核類型確定：用SeqMan軟件合并同一菌株完全相同的ITS序列，并剔除上游引物前端和下游引物末端冗余的堿基；用MEGA v 7.0軟件提取出每個ITS序列中的ITS2序列，然后再用MEGA v 7.0軟件將獲得的ITS2序列與細胞核類型的共有序列進行比對，構建鄰接樹；若獲得的ITS2序列與某一類型的共有序列同源性高，則認為該ITS2序列屬于該類型；最終將同一菌株的所有ITS2序列都進行類型確定，即可確定該菌株最終的細胞核類型；步驟3：創制香菇栽培菌株核質雜交種

將不同的單核菌絲配對在PDA培養基上進行單單雜交，通過在菌落兩端挑取菌絲，在顯微鏡下觀察，如果有鎖狀聯合結構形成，則認為配對的單核菌絲之間是可交配的；

篩選出細胞質和細胞核都為A1型的可交配的兩個栽培單核菌絲，以及細胞質類型為mt-A2型或mt-B型的野生單核菌絲；然后分別將細胞質類型為mt-A2型或mt-B型的野生單核菌絲與一個細胞質和細胞核都為A1型的栽培單核菌絲進行正交，獲得細胞質為mt-A2型或mt-B型、細胞核分別來源于野生單核菌絲和栽培單核菌絲的雙核菌絲；然后將該雙核菌絲進行單核化、進行步驟1中的rrnL基因序列測定和步驟2中的ITS2序列測定，篩選到一個細胞核來源于栽培菌株而細胞質為mt-A2或mt-B型的單核菌絲；然后繼續將該單核菌絲與相應栽培菌株的另一個單核菌絲進行正交，即可獲得一個栽培菌株的核質雜交種，即兩個細胞核來源于栽培菌株，而細胞質來源于mt-A2或mt-B型的野生菌株；

在確定第一種香菇的細胞質類型時，NC_018365.1和MF774812.1的線粒體類型為A1型，KY217797.1的線粒體類型為A2型，MF774813.1的線粒體類型為B型；

確定第二種香菇的細胞核類型時， SeqNo.5所示ITS2序列的細胞核類型為A1型。

2.根據權利要求1所述的利用細胞質和細胞核分子標記創制香菇栽培菌株核質雜交種的方法，其特征在于：為了進一步穩定該核質雜交種的遺傳物質，再將該核質雜交種進行一次回交。